腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)人β-NGF和PDGF-B基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過腺相關(guān)病毒(AAV)載體介導(dǎo)人β-神經(jīng)生長因子(β-NGF_)基因和人血小板源性生長因子基因B(PDGF-B)聯(lián)合轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞,探討其對該細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響。
　　 方法:體外培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、神經(jīng)特異烯醇化酶(NSE)單克隆抗體免疫熒光染色鑒定細(xì)胞的種類及純度。構(gòu)建AAV載體,利用AAV載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白(GFP)基因轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞,根據(jù)其陽性表達(dá)率測定轉(zhuǎn)染效率。AAV

2、-β-NGF和AAV-PDGF-B分別和聯(lián)合轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞后,Real-TimePCR及Westernblot分別在mRNA和蛋白水平檢測轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后β-NGF和PDGF-B的表達(dá)變化。AAV-β-NGF和AAV-PDGF-B分別和聯(lián)合轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞72小時(shí)后,通過MTT檢測細(xì)胞增殖能力的改變,流式細(xì)胞儀測定處于G1期的細(xì)胞比例,檢測外源基因?qū)?xì)胞周期的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)觀察AAV-β-NGF和AAV-PDGF-B對

3、細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 結(jié)果:貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)可形成完整的細(xì)胞單層,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、NSE免疫熒光染色證明為純凈的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞。AAV介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞72h后,熒光顯微鏡下觀察可見細(xì)胞內(nèi)清晰的綠色熒光,測得轉(zhuǎn)染效率可達(dá)67.8%。AAV-β-NGF和AAV-PDGF-B分別和聯(lián)合轉(zhuǎn)染貓內(nèi)皮細(xì)胞后,Real-TimePCR和Westernblot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞中β-NGF和

4、PDGF-B的mRNA和蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長不斷增高,與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組中β-NGF和PDGF-B在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與單獨(dú)轉(zhuǎn)染組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。MTT結(jié)果顯示,AAV-β-NGF和AAV-PDGF-B分別和聯(lián)合轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞后增殖能力較對照組增強(qiáng),聯(lián)合轉(zhuǎn)染組更為明顯,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測AAV-β-NGF和AAV-PDGF-B轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期中G1期細(xì)