人角膜內(nèi)皮細(xì)胞衰老相關(guān)基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的 盡管人角膜內(nèi)皮細(xì)胞(huaman corneal endothelial cells，HCECs)在體外能夠被成功的培養(yǎng)和生長，但正常情況下，在體內(nèi)卻不能發(fā)生增殖，當(dāng)面臨衰老、疾病和手術(shù)等損傷時，角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度(endothelial cell derlsity，ECD)會逐漸下降，一旦發(fā)生功能失代償，多需依靠穿透性角膜移植(penetratingkeratoplasty，PK)來解決，但移植術(shù)后仍然存在ECD超生理性下

2、降的問題，并且這己成為導(dǎo)致遠(yuǎn)期角膜移植失敗的最主要原因。有觀點(diǎn)認(rèn)為，器官功能惡化與該器官中關(guān)鍵的組織細(xì)胞老化有關(guān)，移植物失功也與移植器官組織的加速衰老有關(guān)。因此，對正常HCECs衰老的研究顯得十分重要。ECD和角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的增殖能力均隨著年齡下降，說明HCECs在體內(nèi)可能發(fā)生衰老。研究認(rèn)為，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKI)基因，是幾個重要的衰老相關(guān)基因，

3、在細(xì)胞衰老的過程中發(fā)揮重要的作用，但在正常HCECs衰老發(fā)生過程中的作用尚未見有相關(guān)研究。 基于此，本研究對不同年齡HCECs中p16<'INK4a>、p21<'WAF1/CIP1>、p<'27KIP1>和p53等的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，以揭示正常HCECs衰老過程中起重要作用的關(guān)鍵效應(yīng)物。 方法 1．實(shí)驗(yàn)材料：收集臨床上DX液保存的行角膜移植手術(shù)后剩余的周邊角膜環(huán)狀組織，記錄供體年齡。切取部分組織經(jīng)臺盼藍(lán)-茜素紅

4、雙染法，觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞的活性；并行石蠟切片HE組織學(xué)染色，保證角膜材料組織結(jié)構(gòu)的正常。 2．各衰老相關(guān)基因表達(dá)的定性檢測：對18、33、54、68歲的正常角膜環(huán)行冰凍切片后進(jìn)行免疫組化檢測，以及對不同年齡段(20、30、40、50、60歲，共5組，每組含相同或相近年齡的3～4個角膜環(huán))的角膜，每組獲取單一的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，提取總RNA，行RT-PCR檢測。 3．各衰老相關(guān)基因表達(dá)的定量分析：將20、24、26、30、50

5、、55、56、60歲八組(每組含相同或相近年齡的2～4個角膜環(huán))正常人角膜內(nèi)皮細(xì)胞提取總RNA，行實(shí)時熒光定量PCR檢測，觀察p16<'INK4a>、p21<'WAF1/CIP1>、p27<'KIP1>和p53基因隨年齡的表達(dá)情況。分為兩組，≤30歲為年輕組，≥50歲為老年組，利用非配對t檢驗(yàn)對兩組差別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 4．衰老細(xì)胞的觀察：采用中性衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescenceassociated β-galact

6、osidase，SA-β-GAL)細(xì)胞化學(xué)染色方法，對不同年齡(9、17、23、57、65、67歲)角膜內(nèi)皮細(xì)胞染色的情況進(jìn)行觀察。 結(jié)果 術(shù)后即刻臺盼藍(lán)-茜素紅雙染顯示角膜內(nèi)皮細(xì)胞的平均細(xì)胞密度為(2391.4±84.6)個/mm<'2>，活性率為(84.4±5.3)％。HE染色結(jié)果示角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮各層結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則。冰凍切片的免疫組化結(jié)果可見p16<'INK4a>、p21<'WAF1/CIP1>、p27<'

7、KIP1>和p53等各衰老相關(guān)基因在角膜內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且陽性表達(dá)位于細(xì)胞核內(nèi)。對各年齡段正常HCECs行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示p16<'INK4a>、p21<'WAF1/CIP1>、p27<'KIP1>和p53各衰老相關(guān)基因的目的條帶存在，表達(dá)陽性。熒光實(shí)時定量PCR檢測顯示各年齡段四種基因表達(dá)量強(qiáng)弱不等，p16<'INK4a>的表達(dá)在老年組大于年輕組(t=3.402，P=0.014)，p21<'WAF1/CIP1>、p27<

8、'KIP1>和p53兩組表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SA-β-GAL染色顯示年輕者沒有或者偶見呈現(xiàn)藍(lán)染的陽性細(xì)胞，且染色較淺，老年者則陽性細(xì)胞多見，且染色較深。 結(jié)論 1．體內(nèi)HCECs隨年齡增長會發(fā)生衰老改變，各年齡段HCECs中均有CDKI基因的表達(dá)，且p16<'INK4a>的相對表達(dá)量隨年齡增加而增高，其介導(dǎo)的衰老通路可能在正常HCECs衰老的過程中發(fā)揮著重要作用。 2．本研究為進(jìn)一步探討角膜內(nèi)皮細(xì)胞疾病或慢性角膜