雙親基因載體的構(gòu)筑及在增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率方面的研究.pdf

1、目前，心腦血管疾病手術(shù)治療存在的主要問題是移植物中新生內(nèi)膜增生以及再狹窄等，這些都嚴(yán)重危及患者生命。鑒于內(nèi)皮細(xì)胞的一些天然優(yōu)勢(shì)，植入材料表面快速內(nèi)皮化是材料在體內(nèi)移植成功的關(guān)鍵。基因治療和材料表面的功能化修飾是實(shí)現(xiàn)人工血管植入材料內(nèi)皮化的兩種有效方法。本論文系統(tǒng)地綜述了基因治療和多肽修飾的生物材料在促進(jìn)內(nèi)皮化方面取得的成果。由于內(nèi)皮細(xì)胞固有的轉(zhuǎn)染效率低下，使植入材料在體內(nèi)的內(nèi)皮化效果大受影響。因此，有效提高內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率對(duì)于促進(jìn)人工

2、血管材料的內(nèi)皮化有著最為直接的意義。鑒于陽(yáng)離子基因載體的分子量和靶向活性多肽對(duì)基因的傳遞有重要影響，本論文首先探討了陽(yáng)離子基因載體的分子量對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響，進(jìn)而又設(shè)計(jì)了多肽修飾的新型基因載體，并用于內(nèi)皮細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染研究。
　　第二章.為了考察陽(yáng)離子基因載體的分子量對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響，本章以聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA)為載體主鏈，通過引發(fā)L-丙交酯(LA)開環(huán)聚合，得到PHEMA-PLA嵌段共聚物。不同分子量的親

3、水鏈聚乙二醇單甲醚(PEG)和聚乙烯亞胺(PEI)通過酯化和酰胺化反應(yīng)連接到羧基化的PHEMA-PLA嵌段共聚物上，制備得到四種不同分子量的陽(yáng)離子基因載體：PHEMA-PLA-PEG2 kDa-PEI1.8 kDa、PHEMA-PLA-PEG5 kDa-PEI1.8 kDa、PHEMA-PLA-PEG2 kDa-PEI10 kDa和PHEMA-PLA-PEG5 kDa-PEI10 kDa。進(jìn)而通過溶液自組裝的方法分別構(gòu)建得到四種對(duì)應(yīng)的納

4、米粒：G2I1.8、G5I1.8、G2I10和G5I10。采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)考察了這四種納米粒載體及其與 pEGFP-ZNF580基因形成的復(fù)合物的流體力學(xué)直徑和表面zeta電位的大小。并選取EA.hy926為模型內(nèi)皮細(xì)胞，考察這四種基因載體及其復(fù)合物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)毒性及轉(zhuǎn)染活性的影響。結(jié)果表明適當(dāng)?shù)靥岣哧?yáng)離子基因載體的分子量和在載體中引入 PEG有助于提高載體復(fù)合物在內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。
　　第三章.本章制備了一種REDV

5、(Arg-Glu-Asp-Val)多肽修飾的基因載體，用于負(fù)載 pEGFP-ZNF580基因，考察了靶向活性多肽修飾的載體復(fù)合物在內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。通過開環(huán)聚合和接枝聚合的方法制備得到聚乙二醇單甲醚-聚(丙交酯-co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺(mPEG-P(LA-co-CL)-PEI)兩親性嵌段共聚物。通過CREDVW多肽與mPEG-P(LA-co-CL)-PEI的共價(jià)鍵合反應(yīng)，制備得到REDV多肽修飾的基因載體mPEG-P(LA-co

6、-CL)-PEI-REDV。并通過自組裝的方法制備得到聚合物mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV和mPEG-P(LA-co-CL)-PEI對(duì)應(yīng)的納米粒載體 REDV-NP和NP。通過凝膠電泳的方法考察了兩種載體納米粒對(duì)pEGFP-ZNF580基因的包覆能力。以EA.hy926為模型內(nèi)皮細(xì)胞，借助MTT實(shí)驗(yàn)考察了載體基因復(fù)合物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生物毒性的影響，并考察了載體復(fù)合物在內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向活性多肽 RE

7、DV修飾的基因載體對(duì)pEGFP-ZNF580基因包覆能力強(qiáng)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生物相容性較好，體外轉(zhuǎn)染效率比PEI25 kDa復(fù)合物高，且能有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。
　　第四章.在本章研究中，為了制備多位點(diǎn)連接REDV多肽修飾的基因載體，考察其在內(nèi)皮細(xì)胞中遞送基因的能力，我們以PHEMA主鏈為大分子引發(fā)劑，采用開環(huán)聚合的方法將己內(nèi)酯引入到PHEMA的多條臂肢中，進(jìn)而通過酯化反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)將PEG和小分子量的PEI與羧基化后的PCL鏈端連

8、接，制備得到兩親性的梳型基因載體 PHEMA-PCL-PEG-PEI。借助一種異雙官能團(tuán)連接劑，將REDV活性多肽引入到PEI鏈端，制備得到REDV多肽功能化的兩親性基因載體(PHEMA-PCL-PEG-PEI-REDV)。再通過自組裝的方法構(gòu)筑了這種聚合物納米粒，用于對(duì) pEGFP-ZNF580基因的包載。通過動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)和凝膠成像電泳分析的方法考察了靶向載體對(duì)pEGFP-ZNF580基因包覆能力的大小。以EA.hy926細(xì)胞為模型

9、細(xì)胞，考察了靶向基因載體復(fù)合物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生物毒性及在內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果，并對(duì)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明該 REDV多肽修飾的雙親梳型基因載體可有效包載 pEGFP-ZNF580基因，且不會(huì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，在內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率好，相應(yīng)的蛋白表達(dá)含量高。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陽(yáng)離子基因載體的分子量對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率有著很大的影響，且生物活性多肽修飾的載體及基因復(fù)合物可有效提高內(nèi)皮細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染效率。本文的研