基于納米聚合物的轉(zhuǎn)染方法的建立及其在基因敲除方面的初步研究.pdf

1、殼聚糖和聚乙烯亞胺(PEI)是兩種受到廣泛研究的陽離子聚合物基因載體，能有效濃縮核酸物質(zhì)、保護(hù)其不被降解、將核酸物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞并表達(dá)。而轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)是一種新的分子生物學(xué)編輯工具，能任意靶向基因組任意位點，實現(xiàn)基因敲除等功能。特別設(shè)計構(gòu)建的靶向敲除某個基因的TALEN質(zhì)粒能在細(xì)胞內(nèi)特異性敲除基因組中該基因。本文利用殼聚糖和PEI作為基因載體，將設(shè)計并構(gòu)建的能敲除CCR5基因的TALEN質(zhì)粒對轉(zhuǎn)入細(xì)胞，實現(xiàn)細(xì)胞基因

2、組中CCR5基因的靶向敲除，從而為減少CCR5受體的表達(dá)，阻止艾滋病病毒HIV-1進(jìn)入細(xì)胞，最終治療艾滋病奠定堅實的基礎(chǔ)。本課題分為三部分工作:
　　第一部分是建立以殼聚糖(Chitosan)為載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法。首先通過直接法和間接法制備Chitosan/pDNA復(fù)合物，并以此轉(zhuǎn)染HEK293T、Hela細(xì)胞。結(jié)果顯示，直接法制備的Chitosan/pDNA復(fù)合物并沒有成功轉(zhuǎn)入HEK293T、Hela細(xì)胞，間接法雖然成功制備了大

3、小均勻的殼聚糖球形納米顆粒，但制備復(fù)合物后也沒有成功轉(zhuǎn)入HEK293T、Hela細(xì)胞，因此將殼聚糖作為非病毒載體來傳遞基因需要對其本身物理化學(xué)性質(zhì)、納米顆粒的尺寸、轉(zhuǎn)染機制等進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。
　　第二部分是建立以PEI為載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法。這部分初步建立了以PEI為載體的轉(zhuǎn)染方法，并通過條件優(yōu)化如N/P比的優(yōu)化、轉(zhuǎn)染介質(zhì)的優(yōu)化等對該方法進(jìn)行改善，來提高其傳遞基因進(jìn)入細(xì)胞的效率。在轉(zhuǎn)染過程中使用減血清培養(yǎng)基，且PEI/pDNA

4、復(fù)合物的N/P比例在3～6范圍內(nèi)時，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高，且沒有產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性。
　　第三部分是基于PEI作為基因載體方法的基本建立，將該方法應(yīng)用于艾滋病的基因治療的前期基礎(chǔ)研究，即使用PEI載體將TALEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293T、Hela細(xì)胞進(jìn)行CCR5基因的靶向敲除。本研究首先設(shè)計并成功構(gòu)建了靶向CCR5基因的TALEN質(zhì)粒對，然后以PEI為載體，將其轉(zhuǎn)入HEK293T、Hela細(xì)胞來驗證其靶向敲除CCR5基因的效果，從而為