陽離子聚合物修飾的硅納米線陣列在基因轉染中的應用.pdf

1、基因轉染可用于治療或緩解多種疾病，已成為基礎和臨床研究中不可缺少的醫(yī)療手段?；蜣D染的關鍵問題在于選擇安全高效的基因載體和轉染方法，將核酸物質直接運輸?shù)郊毎藘炔⒏咝П磉_，這也是目前基因轉染技術的瓶頸所在。非病毒型高分子化合物作為基因載體可以在一定程度上提高基因轉染的效率和安全性，其中陽離子聚合物具有易于合成、便于改性且可攜帶較多 DNA進入細胞等優(yōu)點，被廣泛用作基因轉染的基因載體。然而陽離子聚合物很難輔助DNA直接進入細胞核，轉染效率

2、無法進一步提高。同時，陽離子聚合物在細胞內易大量累積并干擾細胞的正常代謝過程而產生細胞毒性。這些缺點極大地限制了陽離子聚合物在臨床上的應用。硅納米線陣列（SN）可以在保持細胞活性的同時刺穿細胞膜甚至細胞核膜，攜帶諸多生物因子進入細胞乃至細胞核。且SN具有較好生物相容性，可支持多種細胞的培養(yǎng)。然而，由于未經(jīng)修飾的SN表面存在硅的氧化層，因此導致DNA負載量較低，限制了其在基因轉染領域的應用。
　　本論文提出了構建以陽離子聚合物修飾的

3、硅納米線陣列作為基因轉染的材料平臺并輔以提高負載量和促進表達等手段的復合基因轉染系統(tǒng)策略，旨在綜合利用硅納米線對細胞核的直接刺穿作用和陽離子聚合物載體對核酸的有效結合與釋放作用，來提高基因轉染的效率并盡可能地降低細胞毒性。具體研究內容如下：
　　首先，構建了一系列核酸載體陽離子聚合物修飾的硅納米線陣列。通過化學修飾的方法將25 kDa的支化聚乙烯亞胺（ PEI）和聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（PDMAEMA）接枝到硅納米線陣列表面得到

4、PEI修飾的硅納米線陣列（SN-PEI）和PDMAEMA修飾的硅納米線陣列（SN-PDM）；為進一步發(fā)揮DNA的負載和釋放效果及細胞在材料表面的黏附及脫附，在SN-PDM中引入聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）鏈段獲得聚（N-異丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸氨基乙酯）（PNIPAAm-co-PDM）修飾的硅納米線陣列（SN-PNIPAAm-PDM）。借助水接觸角測試、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）等手段確定了聚合物

5、的成功接枝并系統(tǒng)地表征了材料的表面特性。同時進一步深入考察了這三種基因轉染的材料平臺對細胞生長的影響，結果發(fā)現(xiàn) SN-PEI和 SN-PDM表面能黏附較多的細胞并實現(xiàn)細胞的良好鋪展和增殖，表明PEI和PDMAEMA對SN的修飾能夠有效提高材料的生物相容性，具有被進一步用作基因轉染材料平臺的潛力和優(yōu)勢。而 SN-PNIPAAm-PDM表面無法維持細胞的正?；钚?，生物相容性較差，不適合被用作轉染材料。
　　在此基礎上，我們提出了由高效

6、核酸結合型載體聚乙烯亞胺（PEI）接枝修飾的硅納米線陣列（SN-PEI）作為基因轉染材料平臺，并輔以生物相容性較好的小分子量PEI與DNA的復合物的轉染體系策略以提高DNA在材料表面上的負載量從而促進基因轉染效率和安全性。探討并系統(tǒng)地考察了SN-PEI表面氨基密度、DNA在材料表面孵育時間以及轉染復合物中小分子PEI與DNA的N/P比（PEI中的氮原子與DNA中磷原子的摩爾比）對基因轉染效率的影響。結果發(fā)現(xiàn)將N/P比為80的小分子PEI

7、（2 kDa）與DNA的混合物孵育在25 kDa PEI接枝時間為3 h的SN-PEI表面10 min后，體系可實現(xiàn)最大的轉染效率。這一策略有效地提高了基因的轉染效率并降低了轉染體系的細胞毒性，然而仍存在一些問題亟需解決，如高分子量 PEI可能存在潛在的細胞毒性、體系中DNA的負載量較低還需補加小分子量PEI與DNA的復合物。
　　為構建更加高效和安全的基因轉染體系，有效提高基因在進入細胞核后的表達，我們進一步提出了以PDMAEM

8、A修飾的硅納米線陣列為材料平臺，輔以傳統(tǒng)的鈣離子依賴型轉染體系的集成策略，以充分利用材料平臺和鈣離子依賴型轉染體系的優(yōu)點，獲得安全、高效負載和高量表達的基因轉染途徑。PDMAEMA具有比PEI更好的生物相容性，傳統(tǒng)鈣離子依賴型轉染體系能夠有效促進DNA的胞內釋放和表達。研究結果表明當鈣離子濃度為100 mM、鈣離子與DNA的復合物在SN-PDM表面的孵育時間與為20 min，PDMAEMA聚合時間為24 h的SN-PDM能夠實現(xiàn)基因高效

9、率的轉染和表達。這個集成策略為基因傳遞提供了一種嶄新的思路，有望在醫(yī)學研究和臨床治療中進一步廣泛應用。
　　綜上所述，在生物相容性好且能夠直接作用于細胞核的硅納米線陣列表面引入高效的基因載體陽離子聚合物PEI與PDMAEMA構建的陽離子聚合物修飾的硅納米線陣列是基因轉染的有效的材料平臺，這種平臺不僅能夠支持細胞的黏附和正常生長增殖，同時能夠包容多種傳統(tǒng)的、安全的基因轉染方法，最終實現(xiàn)高效的，集成的，安全的基因轉染和表達。這種以陽離