嵌段共聚物膠束基因載體在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖方面的研究.pdf

1、本文致力于設(shè)計(jì)和制備基于聚乙烯亞胺(PEI)的低毒性，高轉(zhuǎn)染效率的新型基因載體，以期將促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的ZNF580基因質(zhì)粒遞送到EA. hy926內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的增殖和遷移的目的。
　　1.將低分子量聚乙烯亞胺(PEI, Mw=1800)和聚乙二醇單甲醚(mPEG)分別接枝到可生物降解的聚乳酸-co-羥基乙酸(PLGA)上，得到嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-(聚乳酸-co-羥基乙酸

2、)(mPEG-b-PLGA)和PEI-b-PLGA-b-PEI。經(jīng)過(guò)上述兩種嵌段共聚物的自組裝，制備出以PLGA為疏水核，以mPEG和PEI為混合殼層的復(fù)合膠束，并負(fù)載了能促ECs增殖的DNA質(zhì)粒pEGFP-ZNF580(綠色熒光蛋白融合質(zhì)粒pEGFP-ZNF580)。通過(guò)改變殼層mPEG和PEI的比例可以較容易的降低膠束的細(xì)胞毒性或提高膠束/質(zhì)粒 DNA(pDNA)復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。利用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)研究了復(fù)合膠束體外的降解過(guò)程

3、；DLS結(jié)果表明復(fù)合膠束和膠束/pDNA復(fù)合物的粒徑和zeta電位均適合于細(xì)胞內(nèi)吞；(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)比色法(MTT)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)復(fù)合膠束中mPEG-b-PLGA/PEI-b-PLGA-b-PEI比例為3/1時(shí)，復(fù)合膠束表現(xiàn)出低的細(xì)胞毒性；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，該復(fù)合膠束/pDNA復(fù)合物能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
　　2.為了平衡膠束基因載體的細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率，以實(shí)現(xiàn)基因載體較高的轉(zhuǎn)染效

4、率，同時(shí)降低載體的細(xì)胞毒性，制備了兩種兩親性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚(乳酸-3(S)-甲基-嗎啉-2,5-二酮)(mPEG-b-PLMD)和聚乙烯亞胺-b-聚(乳酸-3(S)-甲基-嗎啉-2,5-二酮)-b-聚乙烯亞胺(PEI-b-PLMD-b-PEI)，通過(guò)這兩種共聚物在水溶液中的自組裝，制備出一系列以PLMD為內(nèi)核，mPEG和PEI鏈段為殼層的復(fù)合膠束。采用這種復(fù)合膠束做為基因載體，負(fù)載了能促 ECs增殖的DNA質(zhì)粒pEGF

5、P-ZNF580。膠束及膠束/pDNA復(fù)合物的流體力學(xué)直徑(Dh)和zeta電位的測(cè)定結(jié)果表明，該基因載體的粒徑和zeta電位都適合于細(xì)胞內(nèi)吞和細(xì)胞轉(zhuǎn)染；膠束/pDNA復(fù)合物的MTT實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)調(diào)節(jié)復(fù)合膠束殼層中mPEG/PEI比例可以方便的調(diào)控基因載體的細(xì)胞毒性和細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；Western blot分析結(jié)果表明該基因載體可以促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)ZNF580蛋白的表達(dá)，而且隨著復(fù)合膠束殼層中PEI鏈段比例的增加，轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)

6、ZNF580蛋白的表達(dá)水平是逐漸升高的；此外，劃痕實(shí)驗(yàn)證明了經(jīng)由膠束/pDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染的EA.hy926細(xì)胞的遷移能力也得到了增強(qiáng)。因此，這種復(fù)合膠束作為基因載體成功的負(fù)載了pEGFP-ZNF580質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)ZNF580基因的成功表達(dá)，細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)，這將加速內(nèi)皮化過(guò)程。這種基因載體系統(tǒng)制備策略可以通過(guò)簡(jiǎn)單調(diào)節(jié)復(fù)合膠束殼層中 mPEG/PEI的比例，便捷的調(diào)控基因載體的細(xì)胞毒性和細(xì)胞轉(zhuǎn)染效

7、率。
　　3.為了實(shí)現(xiàn)基因載體高效進(jìn)入ECs，以提高基因載體對(duì)ECs的轉(zhuǎn)染效率，將內(nèi)皮細(xì)胞選擇性多肽引入嵌段共聚物膠束體系，制備了一種靶向性基因載體。合成了一種兩親性星型嵌段共聚物，(PLMD-b-PEI)6，然后通過(guò)馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-N-羥基丁二酰亞胺(MAL-PEG-NHS)將能特異性吸附內(nèi)皮細(xì)胞的活性多肽 CREDVW連接到共聚物上，得到(PLMD-b-PEI-b-PEG-CREDVW)6。通過(guò)該嵌段共聚物在水溶液中的自

8、組裝得到以疏水的PLMD為核，聚陽(yáng)離子PEI為殼，高親水性的PEG鏈段為冠的核-殼-冠型膠束，該膠束的最外層連接了能特異性吸附內(nèi)皮細(xì)胞的活性多肽 CREDVW。本章用該膠束作為靶向基因載體，負(fù)載了能促進(jìn) ECs增殖的pEGFP-ZNF580質(zhì)粒。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該基因載體具有較低細(xì)胞毒性，并且靶向性多肽的引入可以進(jìn)一步降低基因載體的細(xì)胞毒性；體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和Western blot分析證明了這種基因載體可以壓縮包裹pEGFP-ZNF5

9、80，并攜帶該基因質(zhì)粒進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，使ZNF580基因在細(xì)胞內(nèi)成功的轉(zhuǎn)染并表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)ZNF580蛋白水平也隨之提高；劃痕實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)這種靶向性基因載體轉(zhuǎn)染的EA.hy926細(xì)胞的遷移能力也同時(shí)增強(qiáng)，24 h后，兩種連接靶向多肽的膠束/pDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的遷移面積分別達(dá)到76.2％(PEI/PEG=1/1)和78.5%(PEI/PEG=1/2)。
　　4.制備了兩親性嵌段共聚物 PEI-b-PLMD-b-PEI，通過(guò)該嵌段共

10、聚物在水溶液中的自組裝形成了以疏水的PLMD為內(nèi)核，陽(yáng)離子聚合物PEI為殼的膠束。通過(guò)聯(lián)二硫基雙(琥珀酰亞胺丙酸鹽)(DSP)將低分子量PEI(Mw=600)交聯(lián)在膠束的殼層上，連接成較高分子量的PEI殼層，可以促進(jìn)ECs增殖的質(zhì)粒pEGFP-ZNF580通過(guò)和PEI的靜電作用被壓縮包裹到膠束的殼層。這種通過(guò)交聯(lián)劑將低分子量PEI連接成較大分子量 PEI可以提高基因載體的轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)這種載體具有較低的細(xì)胞毒性，隨著材料濃度的增加，PE