老化髓核細(xì)胞的致退變效應(yīng)及其機(jī)制的探索.pdf

1、目的:
　　體外建立人髓核細(xì)胞復(fù)制性老化和血清剝奪誘導(dǎo)老化的模型，探索兩種老化髓核細(xì)胞對正常髓核細(xì)胞的致退變效應(yīng)并探索其機(jī)制。
　　方法:
　　1、體外連續(xù)傳代、培養(yǎng)人正常髓核細(xì)胞，模擬髓核細(xì)胞復(fù)制性老化過程;
　　2、體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)第9代髓核細(xì)胞，誘導(dǎo)髓核細(xì)胞老化;
　　3、分別對步驟1中的各代細(xì)胞及步驟2中的細(xì)胞行顯微鏡觀察髓核細(xì)胞形態(tài)、SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)細(xì)胞老化率、流式細(xì)胞儀檢測G1期細(xì)胞

2、比例，制備兩組髓核細(xì)胞老化模型（本研究中擬定老化率≥80％、G1期細(xì)胞≥80％的造模組為合格的髓核細(xì)胞老化模型）;
　　4、免疫熒光法觀察P9代髓核細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，同時(shí)對第9代髓核細(xì)胞、復(fù)制性老化模型、血清剝奪誘導(dǎo)老化模型3組細(xì)胞，采用QRT-PCR檢測3組細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)含量;
　　5、建立老化髓核細(xì)胞和正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng)體系，觀察共培養(yǎng)體系中正常髓核細(xì)胞的活力指標(biāo)，Western-blot檢測共培養(yǎng)體系中

3、正常髓核細(xì)胞中ERK、Akt兩條信號傳導(dǎo)通路的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、在建立髓核細(xì)胞復(fù)制性老化模型過程中，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，髓核細(xì)胞形態(tài)逐漸由類圓形、星形、短梭形向長梭形、不規(guī)則形等轉(zhuǎn)變，細(xì)胞體積逐漸增大、胞質(zhì)變脆、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)髓核細(xì)胞老化率、流式細(xì)胞儀檢測G1期細(xì)胞比例，傳至P13代時(shí)兩者比例分別為84.13±4.7％、87.59±3.0％;
　　2、在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)髓核細(xì)

4、胞的模型中，第7d觀察髓核細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則形、長梭形轉(zhuǎn)變，胞質(zhì)變脆、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)髓核細(xì)胞老化率、流式細(xì)胞儀檢測G1期細(xì)胞比例較含10％胎牛血清組明顯增高，其中SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)髓核細(xì)胞老化率為86.70±6.0％，流式細(xì)胞儀檢測G1期細(xì)胞比例為88.34±4.4％;
　　3、免疫熒光法檢測提示P9代髓核細(xì)胞表達(dá)TGF-β1，QRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在復(fù)制性老化模型和血清剝奪誘導(dǎo)老化模

5、型中，TGF-β1的表達(dá)量較正常髓核細(xì)胞均有所減少，差異較對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩個(gè)老化模型組中TGF-β1的表達(dá)量相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　4、在老化髓核細(xì)胞與正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，第7d觀察共培養(yǎng)體系中正常髓核細(xì)胞的活力指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組A（復(fù)制老化髓核細(xì)胞（P13代）與正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng)）、實(shí)驗(yàn)組B（血清剝奪誘導(dǎo)老化的髓核細(xì)胞與正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng)）中老化率及G1期細(xì)胞比例較對照組（單純正常

6、髓核細(xì)胞培養(yǎng)）中均有所上升，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Western-blot檢測提示對照組、實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B中正常髓核細(xì)胞中ERK、Akt表達(dá)無明顯差異，實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B中正常髓核細(xì)胞的pERK、pAkt較對照組表達(dá)減少。
　　結(jié)論:
　　1、通過體外連續(xù)性傳代培養(yǎng)人正常髓核細(xì)胞（至P13代髓核細(xì)胞），其老化率及G1期細(xì)胞比例逐漸增加，成功建立髓核細(xì)胞復(fù)制性老化模型;
　　2、通過體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人正