LncRNA在椎間盤退變過程中調控髓核細胞凋亡的功能及其機制研究.pdf

1、目的：
　　椎間盤的老化和退變是脊柱退變性疾病發(fā)生的前提條件和病理基礎，理解椎間盤老化和退變的生物學機制，開發(fā)有效的治療干預措施以應對椎間盤退變帶來的健康問題已經(jīng)成為當前和未來全球性醫(yī)學難題之一。本研究通過生物信息學分析篩選髓核細胞凋亡調控相關的lncRNA，進而探索lncRNA在椎間盤退變過程中髓核細胞凋亡調控的分子機制，從而為尋找椎間盤退變性疾病治療的新靶點提供科學指導。
　　方法：
　　1、比較三種生物信息學分析

2、軟件，應用TargetScan軟件篩選可能通過miR-155參與髓核細胞凋亡調控的lncRNA。2、RT-PCR檢測髓核細胞轉染miR-155mimics后lncRNA表達調控情況，通過lncRNA及mRNA芯片檢測評估髓核細胞轉染miR-155過表達慢病毒后lncRNA及mRNA表達譜變化，評估m(xù)iR-155作為基因治療靶點可能對髓核細胞功能產生的影響。3、流式細胞分析檢測過表達GAS5 lncRNA后髓核細胞的凋亡情況，Wester

3、n Blot檢測線粒體通路上兩個關鍵凋亡相關蛋白Caspase-3和Bcl-2的表達，驗證GAS5 lncRNA對髓核細胞凋亡調控的影響，探索GAS lncRNA參與髓核細胞凋亡調控的可能機制。
　　結果：
　　1、退變椎間盤髓核組織內共有631個表達上調的lncRNA序列信息較為明確，其中有148個上調的lncRNA包含了178個hsa-miR-155-5p結合位點。符合TargetScan評分標準的lncRNA有16個，

4、NR_002819含有6個hsa-miR-155-5p結合位點，ENST00000511037、NR_027451包含了5個結合位點，19個lncRNA包含了2個結合位點，126個lncRNA包含了1個結合位點。2、GAS5 lncRNA包含了1個hsa-miR-155-5p結合位點，外源性導入hsa-miR-155 mimics72小時后，髓核細胞GAS5 lncRNA表達較陰性對照組明顯下降（P＜0.05）。lncRNA及mRNA表

5、達譜芯片分析共發(fā)現(xiàn)721個差異表達lncRNA（Fc值≥2，P＜0.05），其中492個lncRNA表達上調，229個lncRNA表達下調。芯片檢測的18個GAS5 lncRNA轉錄本均表達下調，僅有GAS5-021表達具有顯著差異（Fc值≥1.5，P＜0.05）。Gene Ontology分析顯示，髓核細胞在miR-155過表達后基因表達發(fā)生了明顯的改變，主要集中在腫瘤、免疫性疾病、退變性疾病及心血管疾病等領域，其中以強直性脊柱炎及滑

6、膜炎與椎間盤的關系最為密切。3、GAS5 lncRNA過表達慢病毒轉染96小時后，髓核細胞GAS5 lncRNA的表達水平提高(P＜0.05)，凋亡蛋白酶Caspase-3表達上調，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下調，髓核細胞的凋亡率較陰性對照組明顯升高(P＜0.05)。
　　結論：
　　lncRNA在退變椎間盤髓核細胞凋亡調控中起到了重要作用，GAS5 lncRNA過表達使得髓核細胞內線粒體凋亡通路上的兩個關鍵蛋白家族成員的表