CKIP-1在巨噬細(xì)胞增殖及極化過(guò)程中的功能及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、巨噬細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，在其發(fā)育過(guò)程中，M-CSF介導(dǎo)的增殖和分化起決定性作用。然而一旦分化成熟，組織中的巨噬細(xì)胞不再受M-CSF的誘導(dǎo)而增殖。在某些特定的生理或病理?xiàng)l件下，終末分化的組織巨噬細(xì)胞又能重新進(jìn)入增殖狀態(tài)，這一過(guò)程依然受到M-CSF的調(diào)控(IL-4也在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要作用)。巨噬細(xì)胞如何啟動(dòng)增殖，又如何進(jìn)入靜息狀態(tài)，這種平衡是怎樣維持的？目前依然不清楚。鑒于M-CSF是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞增殖，分化，存活最為重要的細(xì)胞因子，研究

2、其調(diào)控機(jī)制對(duì)于揭開巨噬細(xì)胞如何維持其數(shù)量平衡有重要意義。目前對(duì)M-CSF信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已有較為深入的認(rèn)識(shí)。相對(duì)于其激活機(jī)制，M-CSF的負(fù)調(diào)控機(jī)制研究的還不是很清楚。
　　巨噬細(xì)胞參與炎癥的發(fā)生，發(fā)展以及消解等各個(gè)階段。在炎癥反應(yīng)的不同階段，巨噬細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)不同的表型。在急性炎癥反應(yīng)（Th1型炎癥反應(yīng)）的起始階段，巨噬細(xì)胞主要呈現(xiàn)M1（促炎）的表型，而在炎癥的消解階段巨噬細(xì)胞則呈現(xiàn)M2（抑炎）的表型。M1和M2是極化的兩個(gè)極端，

3、巨噬細(xì)胞可在這兩個(gè)極端之間發(fā)生轉(zhuǎn)換。最新的研究表明巨噬細(xì)胞的極化與非酒精性脂肪肝，動(dòng)脈粥樣硬化，自身免疫性疾病，肥胖以及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞的極化過(guò)程對(duì)于其自身功能的正常發(fā)揮起到至關(guān)重要的作用，然而決定極化的機(jī)制目前研究得還不是很清楚。鑒定更多在特定條件下調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子，對(duì)于更好的了解巨噬細(xì)胞如何發(fā)揮功能具有重要意義。
　　CKIP-1是一個(gè)與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白，調(diào)節(jié)包括細(xì)胞增殖，分化，凋亡在內(nèi)諸多生

4、物學(xué)效應(yīng)。我們前期的研究及芯片數(shù)據(jù)顯示CKIP-1在免疫系統(tǒng)中，特別是巨噬細(xì)胞中特異性的高表達(dá)。本文的目的即是要鑒定CKIP-1在巨噬細(xì)胞發(fā)育及功能調(diào)節(jié)中的作用，研究其與巨噬細(xì)胞的數(shù)量及功能穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)之間的關(guān)系，并揭示其機(jī)制。
　　本文的研究?jī)?nèi)容及結(jié)論主要包括以下兩個(gè)方面:
　　一）我們的研究發(fā)現(xiàn)CKIP-1是一個(gè)巨噬細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控分子。1）CKIP-1缺失導(dǎo)致體外培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞的增殖加快，存活能力增強(qiáng):CKIP-1-/

5、-的骨髓細(xì)胞在M-CSF介導(dǎo)的體外誘導(dǎo)分化條件下能得到比野生型對(duì)照更多的巨噬細(xì)胞;CKIP-1-/-BMDM處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例比野生型高;BrdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示CKIP-1-/-BMDM增殖比野生型細(xì)胞快;CKIP-1-/-BMDM對(duì)M-CSF撤除造成的細(xì)胞凋亡不敏感;過(guò)表達(dá)CKIP-1能抑制M-CSF介導(dǎo)的32D-CSF1R細(xì)胞增殖。2) CKIP-1敲除小鼠脾臟及神經(jīng)系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，脾臟增大:免疫組化結(jié)果顯示CKI

6、P-1-/-小鼠的腦組織及脊柱中Iba-1陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞（神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞）數(shù)量比野生型多;CKIP-1-/-小鼠脾臟增大，脾細(xì)胞的流式分析結(jié)果顯示單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的比例明顯高于野生型。3）CKIP-1敲除小鼠骨髓中髓系細(xì)胞的比例上升，脾細(xì)胞形成G/M集落的能力增強(qiáng):流式分析結(jié)果顯示敲除小鼠骨髓中CD31-Ly6Chigh的單核前體細(xì)胞，及CD11b陽(yáng)性的髓系前體細(xì)胞比例比野生型對(duì)照高;CKIP-1敲除小鼠來(lái)源的脾細(xì)胞在含有IL

7、-3，IL-6和SCF的半固體培養(yǎng)基中形成集落的數(shù)量比野生型對(duì)照多。4)TRAF6參與了M-CSF介導(dǎo)的Akt激活:敲低TRAF6能抑制M-CSF介導(dǎo)的32D-CSF1R細(xì)胞增殖;在32D-CSF1R細(xì)胞中敲低TRAF6后，M-CSF介導(dǎo)的Akt磷酸化降低。5) CKIP-1負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞增殖的機(jī)制是CKIP-1抑制M-CSF介導(dǎo)的Akt激活:在M-CSF刺激下，CKIP-1-/-BMDM Akt激活比野生型持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng);在加入PI3K

8、的抑制劑后，CKIP-1-/-巨噬細(xì)胞增殖加快的表型消失。6）CKIP-1是GKS3β的一個(gè)直接底物:加入λ磷酸酶后，p-CKIP-1抗體識(shí)別的條帶消失;在普通SDS-PAGE中加入特異性結(jié)合磷酸基團(tuán)的小分子化合Phos-tag能將磷酸化與非磷酸化的CKIP-1分離。
　　二）我們的另一部分工作證明CKIP-1是一個(gè)調(diào)控巨噬細(xì)胞M1/M2極化平衡的重要分子。1) CKIP-1敲除小鼠對(duì)LPS介導(dǎo)的內(nèi)毒素休克耐受:在致死劑量的LPS

9、刺激下，CKIP-1敲除小鼠仍然有80％存活（此時(shí)野生型小鼠大部分已經(jīng)死亡）;對(duì)LPS刺激后小鼠血清中的炎性因子的分析顯示，CKIP-1敲除小鼠體內(nèi)TNF-α，IL-6等促炎因子的水平明顯低于野生型對(duì)照。2）CKiP-1-/-巨噬細(xì)胞分泌促炎因子的能力減弱:在用PGN，LPS，Poly(I∶C)等不同的TLR配體刺激條件下，CKIP-1-/-BMDM分泌IL-6和TNF-α的水平比野生型低;用LPS刺激CKIP-1-/-腹腔巨噬細(xì)胞得到

10、類似的結(jié)果。3）CKIP-1抑制M2極化:IL-4/IL-13刺激條件下，CKIP-1-/-BMDM比野生型細(xì)胞表達(dá)更高水平的M2標(biāo)志基因Ym1和Fizz1; IL-4刺激條件下，CKIP-1-/-腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)Ym1的水平比野生型高;在Chitin誘導(dǎo)的Th2型炎癥反應(yīng)條件下，CKIP-1-/-小鼠腹腔細(xì)胞表達(dá)更高水平的Arg1，Ym1，F(xiàn)izz1。4）CKIP-1調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中M1/M2的平衡:在LPS誘導(dǎo)的Th1型炎

11、癥反應(yīng)條件下，CKIP-1-/-小鼠腹腔細(xì)胞中iNOS，TNF-α，IL-12等M1標(biāo)志基因的表達(dá)水平比野生型對(duì)照低，而M2的標(biāo)志基因Arg1，Ym1，F(xiàn)izz1表達(dá)水平比野生型高。
　　綜上所述，我們的研究證明CKIP-1是一個(gè)巨噬細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控分子:CKIP-1通過(guò)抑制TRAF6介導(dǎo)的Akt泛素化抑制M-CSF下游的PI3K-Akt通路的激活，同時(shí)CKIP-1又可被Akt的下游分子GSK3β磷酸化，進(jìn)而降解。CKIP-1與A

12、kt，GSK3β之間形成一個(gè)負(fù)反饋環(huán)路，共同調(diào)節(jié)M-CSF介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖穩(wěn)態(tài)。我們還發(fā)現(xiàn)CKIP-1對(duì)于調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1/M2極化的平衡起重要作用:CKIP-1能抑制M2極化，促進(jìn)M1極化;CKIP-1敲除小鼠對(duì)LPS引起的內(nèi)毒素休克耐受;CKIP-1-/-巨噬細(xì)胞分泌促炎因子的能力減弱。在Th2型炎性因子IL-4/IL-13及Chitin的刺激下，CKIP-1-/-巨噬細(xì)胞表達(dá)更高水平的Ym1等M2標(biāo)志分子。
　　巨噬細(xì)胞增