CKIP-1負控間充質干細胞成脂分化研究.pdf

1、間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是一類廣泛存在于出生后機體多種組織的多能干細胞,較少涉及到諸如胚胎干細胞的倫理學問題。一般認為在適合條件下,MSCs可以分化為成骨細胞、成脂細胞及成軟骨細胞。近些年來又發(fā)現(xiàn)了MSCs的一些新功能,例如支持造血、抑制T細胞免疫反應等。不僅如此,一些基于MSCs的細胞療法已經(jīng)展開嘗試和應用,并取得了良好的進展。
　　目前肥胖、糖尿病以及其他代謝性疾病已經(jīng)成為世界范圍

2、內的首要健康威脅,這些疾病與脂肪細胞的發(fā)育和功能異常有著非常密切的聯(lián)系。成脂分化是MSCs多向分化的重要組成部分,這一過程受到復雜而又精密的調控。簡而言之,MSCs受到外界成脂分化信號刺激后,會激活一系列關鍵轉錄因子的表達,而這些轉錄因子繼而轉錄出大量脂肪細胞特異的基因來執(zhí)行特化的功能,最終完成MSCs向成熟脂肪細胞的轉變。目前認為,C/EBPα和PPARγ是成脂分化中的最為關鍵的轉錄因子,對它們的轉錄調控研究有重要的意義。
　　

3、CKIP-1是我們實驗室開展研究多年的基因,其蛋白產物N端含有PH結構域,C端含有亮氨酸拉鏈結構域,認為其主要定位在細胞近質膜區(qū)。近年來我們實驗室建立了ckip-1-/-小鼠模型,并在體內水平證明CKIP-1可以增強泛素連接酶Smurf1的活性,抑制成骨前體細胞的分化和礦化能力。因為MSCs是成骨、成脂前體細胞的共同干祖細胞,所以我們在本論文中利用敲除小鼠模型來探討CKIP-1缺失對MSCs成脂分化的影響。
　　我們采用了從密質骨

4、中分離MSCs的方法,得到了表面抗原均一的高純度ckip-1+/+和ckip-1-/-MSCs,并進行了相關干細胞性能驗證。在隨后的實驗中我們發(fā)現(xiàn):
　　1.ckip-1-/-小鼠MSCs成脂分化能力增強,關鍵標志物(marker)基因表達水平顯著升高,其中C/EBPα尤為明顯,而且這種升高早在轉錄水平已經(jīng)發(fā)生。我們首先發(fā)現(xiàn)CKIP-1蛋白表達在MSCs成脂分化中發(fā)生明顯變化,隨后在比較ckip-1+/+和ckip-1-/-MSC

5、s成脂分化能力時發(fā)現(xiàn),ckip-1-/-MSCs中出現(xiàn)的脂肪細胞顯著增多。在將不同培養(yǎng)代數(shù)的ckip-1+/+和ckip-1-/-MSCs進行成脂分化誘導時,我們發(fā)現(xiàn)ckip-1-/-MSCs顯示出更高水平的成脂marker基因表達,其中C/EBPα最為顯著。而且通過報告基因實驗,我們證明了過表達CKIP-1也可以抑制C/EBPα的下游效應。
　　2.首次證明生理狀態(tài)下CKIP-1可以定位在細胞核中,并與C/EBPα的轉錄抑制因子

6、——組蛋白去乙?；窰DAC1存在相互作用。目前對C/EBPα的轉錄調控機制了解得比較清楚的是:成脂分化啟動后,其他兩個C/EBP轉錄因子家族成員C/EBPβ與δ會結合在C/EBPα的啟動子區(qū)激活其轉錄,而組蛋白去乙?；窰DAC1作為轉錄共抑制子,也會被招募到該區(qū)域。HDAC1會降低組蛋白H3及H4乙?；?延緩遲滯RNA聚合酶II對C/EBPα的轉錄。我們的數(shù)據(jù)表明CKIP-1可以和上述蛋白復合體中的HDAC1共定位在MSCs的細

7、胞核,并與HDAC1發(fā)生內源、外源相互作用,且這種相互作用不需要借助其他分子。
　　3.CKIP-1可以增強HDAC1與C/EBPα啟動子區(qū)的結合,從而抑制C/EBPα的轉錄。我們發(fā)現(xiàn)與脂肪前體細胞系不同,在MSCs中HDAC1組成型結合于C/EBPα的啟動子區(qū),而非被招募;在成脂分化初期,HDAC1與該區(qū)結合能力減弱,從其上發(fā)生解離。與ckip-1+/+MSCs相比,在ckip-1-/-MSCs中,成脂分化啟動后結合在該啟動子區(qū)

8、的HDAC1顯著減少,相應地,結合在該區(qū)的Ac-H3與RNA聚合酶II顯著增多。過表達CKIP-1可以減弱HDAC1與該啟動子區(qū)的解離,這證明CKIP-1確實可以通過增強HDAC1與該啟動子區(qū)的結合能力來抑制C/EBPα的轉錄。
　　4.在高脂飲食下,ckip-1-/-小鼠體重增長比ckip-1+/+小鼠更為顯著。經(jīng)過脂肪含量60％的飼料喂養(yǎng)后,ckip-1-/-小鼠體內主要的脂肪團質量以及瘦素水平也顯著高于ckip-1+/+小鼠

9、,并顯示出更為嚴重的脂肪肝表型。
　　綜上,我們發(fā)現(xiàn)了CKIP-1基因的另一新功能——抑制MSCs成脂分化,并首次揭示了其在生理條件下的核定位。近期本實驗室與中國航天員訓練科研中心的合作研究也顯示CKIP-1可以抑制心肌肥大,再聯(lián)系到前期CKIP-1抑制成骨細胞分化的結果,我們認為CKIP-1是一個廣譜系抑制干祖細胞分化的基因。此外,對成脂分化而言,前期的認識大多來自脂肪前體細胞系中(如3T3-L1)。我們通過基因敲除小鼠的模型,

10、揭示了CKIP-1可以增強HDAC1對C/EBPα的轉錄抑制而負調控MSCs的成脂分化,并發(fā)現(xiàn)在MSCs中,HDAC1對C/EBPα的轉錄調控具有自身的特點,這些工作都豐富了對成脂分化中C/EBPα轉錄調控的認識。
　　另外,我們在實驗中還得到了一些意外的發(fā)現(xiàn)。雖然小鼠作為應用最為廣泛的模式生物,但是依照傳統(tǒng)方法從骨髓中分離MSCs存在著許多困難。近些年來有研究者指出小鼠長骨密質骨是MSCs的一個重要來源,并發(fā)展出全新的分離方法,

11、而且有數(shù)據(jù)表明這種方法可以分離到比骨髓中更多更純的MSCs。根據(jù)已有認識,密質骨也存在于頂骨。應用相似的方法,我們從小鼠頂骨密質骨中也分離到了與長骨來源的MSCs細胞形態(tài)、表面抗原都高度相似的細胞。盡管如此,我們發(fā)現(xiàn)頂骨來源的這些細胞內成骨轉錄因子osterix表達遠高于長骨來源的MSCs。隨后我們將這兩種不同骨來源的細胞進行了誘導分化實驗。與長骨來源的MSCs可以輕易分化為脂肪細胞不同,頂骨來源的細胞喪失了成脂分化的能力。與這一表型相

12、一致,成脂分化的marker基因如PPARγ、C/EBPα及aP-2mRNA水平在頂骨來源的細胞中遠低于長骨來源的MSCs。而對于成骨分化而言,經(jīng)過誘導后,頂骨來源的細胞中成骨分化的marker基因如Runx2,osterix及osteocalcin mRNA水平顯著高于長骨來源的MSCs,并展示出顯著增強的分化活性及礦化細胞外基質的能力。這些數(shù)據(jù)說明了這群頂骨來源的細胞更像是分化命運已經(jīng)決定的祖細胞(committed progeni