AF1q在神經(jīng)發(fā)育中的功能及調(diào)控機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行了論述。
　　第一部分 AF1q的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　目的：
　　研究在阿爾茨海默病中AF1q的表達是否具有特異性，并明確與神經(jīng)發(fā)育及阿爾茨海默病致病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子REST蛋白對AF1q的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制，從而進一步認識兩者的重要關(guān)系。
　　方法：
　　1.應(yīng)用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)法檢測AD鼠模型B6C3-Tg(APPswe，PSEN1

2、 dE9)及其同窩陰性小鼠中AF1q表達的差異性。
　　2.研究轉(zhuǎn)錄因子REST對人類AF1q基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　2.1細胞轉(zhuǎn)染。
　　2.2啟動子質(zhì)粒的構(gòu)建。
　　2.3將REST高表達質(zhì)粒pREST或其空白對照與啟動子質(zhì)粒pAF1 qpromoter或其對照pGL3-Basic應(yīng)用Lipofectamine2000共同轉(zhuǎn)染HEK293細胞，24小時后收集細胞，Luciferase檢測REST對AF1q啟動子

3、活性的影響。
　　3.AF1q啟動子功能性NRSE位點的確定。
　　3.1結(jié)合位點預(yù)測。
　　3.2構(gòu)建含有或者不含有預(yù)測NRSE位點的截短AF1q啟動子載體，應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染HEK293細胞，24小時后Luciferase檢測構(gòu)建的截短載體啟動子活性;并且分別與REST高表達質(zhì)粒或者其對照質(zhì)粒應(yīng)用Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，Luciferase檢測REST對不同

4、截短啟動子的作用功能，初步找出轉(zhuǎn)錄因子REST對AF1q啟動子的調(diào)控位點。
　　3.3凝膠遷移率試驗和染色質(zhì)免疫共沉淀試驗從體內(nèi)體外兩方面驗證功能性NRSE位點。
　　4.應(yīng)用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測AF1q與REST在C57BL/6小鼠大腦發(fā)育過程中的表達情況。
　　5.統(tǒng)計分析:應(yīng)用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用t檢驗和Sperman相關(guān)分析對數(shù)據(jù)分別進行差異性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

5、
　　結(jié)果：
　　1.與同齡陰性對照小鼠相比，APPswe/PSEN1dE9雙陽性B6C3-Tg小鼠中AF1qmRNA的表達量相對較低;提示AF1q水平的降低可能與AD的致病相關(guān)，AF1q可能是參與AD的致病過程的相關(guān)分子。
　　2.REST可以抑制人類AF1q基因的轉(zhuǎn)錄。
　　2.1 REST高表達后內(nèi)源性AF1q mRNA的表達量降低，而敲除REST后內(nèi)源性AF1q mRNA表達量升高;提示轉(zhuǎn)錄因子REST能

6、夠下調(diào)AF1q的轉(zhuǎn)錄。
　　2.2與pGL3-Basic相比，Luciferase檢測示pAF1 qpromotor的熒光素酶活性明顯升高，說明克隆的AF1q啟動子序列具有啟動子活性。
　　2.3與對照組相比，REST能夠抑制AF1q啟動子的活性，說明REST通過抑制AF1q啟動子的活性來下調(diào)AF1q的轉(zhuǎn)錄。
　　3.AF1q基因啟動子功能性NRSE位點的確定。
　　3.1計算機Jaspar軟件預(yù)測AF1q啟動子

7、區(qū)域的具有2個結(jié)合位點;
　　3.2 Luciferase檢測證實構(gòu)建的截短啟動子均具有啟動子活性;
　　3.3 EMSA和ChIP均驗證功能性NRSE位點位點位于-383～-363bp。
　　4.AF1q與Rest在正常成年小鼠大腦神經(jīng)發(fā)育過程中呈負相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.AFq在AD鼠中的表達明顯低于正常對照組小鼠。
　　2.REST可以抑制人類AF1q基因的轉(zhuǎn)錄。
　　3.人類AF1q

8、基因啟動子區(qū)-383～-363bp可與REST結(jié)合，發(fā)揮功能性NRSE位點的作用。
　　4.AF1q與Rest在正常小鼠大腦神經(jīng)發(fā)育過程中呈負相關(guān)。
　　第二部分 AF1q通過TCF7激活Wnt信號通路參與神經(jīng)發(fā)育的過程的研究
　　目的：
　　研究AF1q在神經(jīng)發(fā)育中的功能作用;并揭示AF1q作為Wnt信號通路的新分子，調(diào)控Wnt信號通路的分子機制;明確AF1q與TCF7之間相互作用，以完善Wnt信號通路。

9、>　　方法：
　　1.研究AF1q在神經(jīng)源性細胞SH-SY5Y中的功能。
　　1.1質(zhì)粒的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染。
　　1.2病毒包裝及細胞感染。
　　1.3將AF1q表達質(zhì)粒pEGFP-AF1q-C3和對照質(zhì)粒應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞中，共聚焦顯微鏡下觀察AF1q在細胞中的定位。
　　1.4 MTT檢測細胞的增殖。
　　1.5 EdU檢測細胞的增殖。
　　1.6流式

10、細胞術(shù)檢測細胞周期。
　　2.研究AF1q對神經(jīng)干細胞的增殖和分化的作用。
　　2.1神經(jīng)干細胞的獲取。
　　2.2病毒感染。
　　2.3測量神經(jīng)干細胞球大小和數(shù)目。
　　2.4檢測神經(jīng)干細胞分化能力。
　　3.AF1q作用于Wnt信號通路的分子機制研究。
　　3.1 TOP-Flash&FOP-Flash熒光素酶活性檢測。
　　3.2免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitatio

11、n，Co-IP)實驗檢測AF1q蛋白與TCF7結(jié)合作用。
　　3.3 Western blot分析AF1q結(jié)合TCF7蛋白后TCF7蛋白的穩(wěn)定性。
　　3.4 TCF7的核轉(zhuǎn)錄。
　　3.5 EdU檢測AF1q通過TCF7發(fā)揮功能。
　　3.6 Co-IP明確AF1q與TCF7的結(jié)合位點。
　　3.7 AF1q的磷酸化與TCF7的作用關(guān)系。
　　4.統(tǒng)計分析:應(yīng)用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用t檢

12、驗進行差異性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.AF1q促進細胞的增殖。
　　1.1RT-PCR結(jié)果顯示與對照組相比，構(gòu)建的pcDNA3.1-AF1q-6myc質(zhì)粒以及pEGFP-AF1q-C3質(zhì)粒，均能夠上調(diào)AF1q的表達。熒光顯微鏡下觀察pEGFP-AF1q-C3能夠表達綠色熒光融合蛋白。
　　1.2RT-PCR結(jié)果顯示與對照組相比，含AF1q表達載體的慢病毒lenti-AF1q能夠上

13、調(diào)AF1q表達。
　　1.3共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)AF1q主要定位于細胞漿中，細胞核中比較少，而在處于細胞分裂狀態(tài)的細胞中AF1q在核膜周圍有顆粒狀匯集，表明AF1q主要在細胞漿中發(fā)揮作用。
　　1.4 MTT檢測表明，與對照組相比，AF1q高表達能夠促進SH-SY5Y細胞的增殖。
　　1.5 EdU檢測表明，與對照組相比，AF1q高表達能夠促使SH-SY5Y細胞處于增殖狀態(tài)的增多。
　　1.6流式細胞術(shù)檢測細胞周

14、期顯示，與對照組相比，AF1q高表達能夠促進細胞處于S期，G2期且使處于G1期的細胞比例減少。說明AF1q能夠影響細胞周期。
　　2.AF1q促進神經(jīng)干細胞的增殖并抑制其向神經(jīng)元方向分化。
　　2.1細胞免疫化學(xué)Nestin染色證實分離獲得的懸浮細胞球為神經(jīng)干細胞。
　　2.2 RT-PCR證實AF1q表達載體的慢病毒lenti-AF1q能夠感染神經(jīng)干細胞，并上調(diào)AF1q表達。
　　2.3顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照

15、組相比，AF1q高表達能夠促進神經(jīng)干細胞球變大和增加半徑較大的神經(jīng)干細胞球的數(shù)目。
　　2.4 RT-PCR檢測證實與對照組相比，AF1q能夠抑制神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的分化。
　　3.AF1q通過與TCF7相互作用激活Wnt信號通路。
　　3.1 TOP-Flash&FOP-Flsh熒光素酶活性檢測表明AF1q能夠激活Wnt信號通路。
　　3.2 Co-IP實驗檢測AF1q蛋白能夠與TCF7相互作用，而與LEF

16、1或β-catenin沒有相互結(jié)合。
　　3.3 Western blot分析顯示，與對照組相比，在AF1q存在的條件下，TCF7蛋白的表達量增加，而且加入CHX后，TCF7的降解速率明顯減慢。
　　3.4 Western blot分析顯示，與對照組相比，AF1q高表達后，細胞核中TCF7的含量明顯增加，說明AF1q能夠促進TCF7的核轉(zhuǎn)錄。
　　3.5干擾TCF7蛋白的表達，導(dǎo)致AF1q促進細胞增殖的效果降低，說明A

17、F1q是通過TCF7來間接的促進細胞的增殖。
　　3.6 Co-IP明確AF1q與TCF7的結(jié)合位點位于AF1q蛋白上第11-20氨基酸位點。
　　3.7 AF1q11位點的磷酸化是與TCF7結(jié)合并發(fā)揮作用的關(guān)鍵位點。
　　結(jié)論：
　　1.AF1q促進SH-SY5Y細胞的增殖。
　　2.AF1q促進神經(jīng)干細胞的增殖并抑制其向神經(jīng)元方向的分化。
　　3.AF1q通過與TCF7相互作用激活Wnt信號通路。