接頭蛋白TRAF與CKIP-1、Smurf1的相互作用及功能研究.pdf

1、Smurfl(Smad ubiquitination regulatory factor l)是HECT類泛素連接酶(E3) Nedd4家族中的成員之一，主要介導(dǎo)成骨細(xì)胞中BMP信號通路中蛋白分子的降解。Smurfl最早于1999年在尋找Smadl相互作用分子時被克隆，它是發(fā)現(xiàn)的第一個可以降解Smads的E3，這使得TGF—β/BMP通路與泛素．蛋白酶體降解通路聯(lián)系起來。除Smad外，近期研究表明生理條件下，Smurfl特異泛素化降解磷

2、酸化形式的MEKK2，從而負(fù)調(diào)控MEKK2—JNK—AP-1通路，抑制成骨細(xì)胞分化。酪蛋白激酶．2相互作用蛋白-1(casein kinase2 interacting protein-1，CKIP-1)是一個含PH結(jié)構(gòu)域的質(zhì)膜定位蛋白。2008年本實驗室發(fā)表在Nature Cell Biology的文章揭示CKIP-1是Smurfl E3活性的增強(qiáng)分子。Smurfl的兩個WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合底物，而中間的連接區(qū)結(jié)合CKIP-1，因此CKIP

3、-1、Smurfl、底物(如Smad1/5)之間就形成了“調(diào)控分子—E3—底物”三元復(fù)合物，CKIP-1增強(qiáng)Smurfl與底物的親和力，加速底物泛素化。這是首次發(fā)現(xiàn)Smurfl的調(diào)控分子。 TRAF(TNF receptor associated factor)家族分子作為胞內(nèi)接頭蛋白，能介導(dǎo)TNF受體、Toll樣受體和IL-1受體超家族成員與多種下游信號通路包括NF—KB和JNK通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而參與骨代謝、先天性和獲得性

4、免疫、胚胎發(fā)育、應(yīng)激響應(yīng)等多種生物學(xué)過程。與TRAFs結(jié)合的蛋白都含有一個或多個TRAF相互作用模序(TRAF—interacting motif， TIM)。CKIP-1中含有多個TIM模序，本文用免疫共沉淀技術(shù)證明了TRAFs與CKIP-1間的相互作用，其中TRAF1、TRAF4與CKIP-1結(jié)合較強(qiáng)，隨后確定了TRAFs與CKIP-1結(jié)合的區(qū)域為C—TRAF結(jié)構(gòu)域。通過報告基因?qū)嶒灡砻?，過表達(dá)CKIP-1可以上調(diào)NF—kB的轉(zhuǎn)錄活

5、性。 在研究TRAFs與CKIP-1相互作用的同時，本實驗室利用酵母雙雜交技術(shù)，以Smurfl介導(dǎo)底物結(jié)合的WW結(jié)構(gòu)域(236—340aa)為誘餌蛋白，從成人腦文庫中篩選到TRAF4(1—363aa)為候選相互作用蛋白。進(jìn)而我們利用免疫共沉淀及GST pull—down技術(shù)，證明Smurfl與TRAF4可直接相互作用，這種相互作用是由Smurfl的WW2結(jié)構(gòu)域及TRAF4的PY模序介導(dǎo)的。蛋白水平分析及體內(nèi)泛素化實驗表明，TRA

6、F4是Smurfl的一個新的底物，且CKIP-1可以促進(jìn)Smurfl對TRAF4的泛素化降解。隨后的報告基因?qū)嶒?，也在NF-1B轉(zhuǎn)錄活性上進(jìn)一步印證了Smurfl對TRAF4的依賴蛋白酶體的泛素化降解作用。綜上結(jié)論，TRAF4與Smurfl、CKIP-1結(jié)合，符合CKIP-1促進(jìn)Smurfl泛素化并依賴蛋白酶體降解底物的規(guī)律，進(jìn)一步揭示了CKIP-1對Smurfl的E3調(diào)控具有普適性。目前關(guān)于CKIP-1、Smurfl在免疫信號通路中的