RanBPM和TRAF6相互作用及其功能的研究.pdf

1、神經(jīng)營養(yǎng)素能夠影響脊椎動物神經(jīng)元的增殖、分化、凋亡、存活等生命過程，但其功能的發(fā)揮則需要Trk和p75NTR兩種膜受體的存在。RanBPM(Ranbinding　proteinin microtubule organizing center)是Trk和p75NTR的下游信號分子，開始是作為Ran的結(jié)合蛋白而發(fā)現(xiàn)的，并參與微管的成核現(xiàn)象而命名，是一種廣泛表達而又高度保守的蛋白，其分子量為90kDa。已有研究證實RanBPM可以與多種蛋白相

2、互作用，其中包括跨膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)信號分子。這些相互作用的蛋白主要包括受體Met、整合素LFA-1、種系特異性的RNA解旋酶、鼠脈管同源蛋白Mvh(mouse vasa homolog protein)周期蛋白依賴性激酶11(CDK11或P46)、神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75NTR、人精子膜蛋白、Calbindin D28K、Twal、PDGB(porphobilinnogendeaminase、USP11、p73、Raf、酪氨酸激酶受體Axl和

3、Sky、神經(jīng)營養(yǎng)素受體TrkA等等。 TRAF6是多種生理過程的信號調(diào)節(jié)分子，先天性和獲得性免疫、骨代謝、淋巴結(jié)發(fā)育、乳腺發(fā)育甚至皮膚和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育無不與TRAF6密不可分。作為接頭分子，TRAF6在七種已發(fā)現(xiàn)的的TRAFs蛋白中顯得極為特殊，是唯一直接參與TNFR和IL-lR／TLR兩個超家族信號傳導(dǎo)的TRAF信號分子。因此TRAF6是阻斷多發(fā)性骨髓瘤增值和存活的重要分子。文獻報道以及我們前期的工作表明TrkA和p75N

4、TR都與RanBPM和TRAF6在信號通路上相關(guān)聯(lián)。在信號通路中，往往許多通路相互交叉而形成網(wǎng)絡(luò)影響細(xì)胞的新陳代謝、生長分化?；谏鲜隹紤]，我們認(rèn)為RanBPM和TRAF6可能有相互的作用，并且有其特定的功能： 1、利用生物學(xué)分析軟件，我們得知RanBPM與TRAF6可以相互作用，作用位點在RanBPM的SPRY結(jié)構(gòu)域內(nèi)； 2、過酵母雙雜體系、過表達免疫共沉淀和內(nèi)源性免疫共沉淀方法證明了RanBPM 能夠與TRAF6相

5、互作用。 3、通過用NF kappa B作為報告基因證明了RanBPM可以降低TRAF6引起的NFkappa B通路的信號的傳導(dǎo)。 4、利用細(xì)胞計數(shù)方法檢測了共同轉(zhuǎn)染RanBPM和TRAF6時可以提高細(xì)胞的增殖。 5、確定了RanBPM與TRAF6相互作用的區(qū)域是RanBPM的SPRY區(qū)。 6、用NGF刺激MCF7，發(fā)現(xiàn)TRAF6和RanBPM的相互結(jié)合的量增加。 7、TRAF6參與了TrkA、R

6、anBPM、p75和Snapin免疫復(fù)合物的形成。 本實驗室以前的用酵母雙雜交體系、過表達免疫共沉淀和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)證明了TrkA、p75可以分別與RanBPM可以相互作用，現(xiàn)在在本論文中用MCF7、MD-MDA-231和293T細(xì)胞證明了內(nèi)源性TrkA、p75可以分別與RanBPM可以在體內(nèi)相互作用。 ARBP(Apoptosis Related Basic Protein)是許多細(xì)胞中存在的參與細(xì)胞凋亡

7、的蛋白；Snapin是本實驗室以ARBP為誘餌蛋白通過酵母雙雜交而獲得的捕獲蛋白，此蛋白是參與神經(jīng)突觸信號傳遞的重要輔助蛋白。我們在大腸桿菌中表達并純化了ARBP和Snapin的融合蛋白，并利用新西蘭大白兔制備了他們的抗體。這為以后研究這兩種蛋白提供了有力的工具。 根據(jù)本實驗室以前的研究成果，我們已經(jīng)確定ARBP和Snapin在酵母雙雜交體系中有相互的作用，這可以用在三缺的SD板上生長和X-gal變藍來證實他們的相互作用。因此我

8、們在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了pCMV-ARBP和pCMV-Snapin表達載體，我們確定ARBP可以抑制Snapin的表達。在此基礎(chǔ)上，我們又發(fā)現(xiàn)ARBP可以提高真核翻譯起始因子4A(eIF4A)的表達。 TrkA與已有研究報道能夠與Snapin相互作用并激活下游的信號通路的肝細(xì)胞生長因子的受體MET相比具有37％的同源性，我們又通過實驗對參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的蛋白Snapin和TrkA進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 在酵母體雙雜體系中