上游刺激因子2(USF2)對Smurf1和Smurf2的功能調控研究.pdf

1、研究目的:
　　 證明USF2是泛素連接酶Smurf1和Smurf2的負性轉錄因子，對Smurf1/2在轉錄水平及蛋白水平上有抑制作用，并對其作用機制進行初步探討，更進一步研究USF2對Smurf1/2的發(fā)揮抑制作用的功能區(qū)域。
　　 研究方法:
　　 一.USF2與其截短體真核表達載體的構建
　　 1.Myc-USF2與其截短體Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)的

2、構建根據USF2基因序列設計PCR引物，提取細胞總RNA，逆轉錄后得到cDNA文庫。再以cDNA為模板，分別取USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)上下游引物，進行PCR擴增得到目的基因片段。擴增產物經電泳分離、回收、酶切后，插入pCMV-Myc的多克隆位點Kpn(Ⅰ)和Sal(Ⅰ)之間。連接產物經E.coliDH5α菌株轉化后，挑取單克隆并提取質粒，經限制性雙酶切鑒定后，陽性克隆送測序測序，測序正確的即為

3、Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。
　　 2.轉染真核細胞驗證重組質粒的表達
　　 各重組質粒轉染細胞48小時后，收取細胞，制作蛋白樣品，后經由Westernblot驗證其在真核細胞中的正確表達。
　　 二.USF2對Smurf1、Smurt2的功能調控研究
　　 1.Smurf1/2對USF2的調控作用
　　 梯度轉染Flag-Smurf1或Flag-

4、Smurf2，48小時后，收取并裂解細胞，制作蛋白樣品，經Westernblot驗證其在細胞中對USF2的調控作用。內源性免疫共沉淀(Co-IP)實驗驗證Smurfs和USF2是否存在相互作用，實驗組使用USF2抗體進行IP，對照組使用小鼠NormalIgG抗體，Smurf1抗體和Smurf2抗體檢測IP樣品，以此判斷USF2與Smurf1或Smurf2之間有無相互作用。
　　 2.USF2抑制Smurf1/2的轉錄表達

5、　　 梯度過表達Myc-USF2，Westernblot檢測Smurf1/2的蛋白水平的變化，再利用實時定量PCR技術檢測Smurf1/2的mRNA水平，檢測USF2對Smurf1/2蛋白及轉錄水平的影響。為了進一步驗證USF2對Smurf1/2的調節(jié)作用，細胞中依次轉染USF2siRNA及ControlsiRNA，敲低細胞內源USF2，再分別利用Westernblot和實時定量PCR技術檢測Smurf1/2蛋白水平和轉錄水平的變化。

6、利用生物信息學段分析Smurf1/2的啟動子區(qū)是否含有E-box結構域，之后構建了含有Smurf1/2promoter區(qū)E-box結構域的PGL3-enhance報告基因載體，通過雙熒光素酶報告基因實驗來驗證USF2對Smurf1/2啟動子活性的抑制作用。
　　 3.USF2結合Smurf1/2啟動子區(qū)
　　 本實驗設計體內、體外實驗，來確認USF2可以結合Smurf1/2啟動子區(qū)，進一步證實USF2是Smurf1/2的

7、轉錄抑制因子。首先設計引物，進行體內染色質免疫沉淀(ChIP)實驗，從而證實在體內USF2可以結合Smurf1/2啟動子區(qū)。為了確證USF2在體外可以直接結合Smurf1/2啟動子區(qū)，我們首先純化GST-USF2蛋白，并驗證其正確表達，然后制作包含Smurf1/2E-box結構域的生物素標記探針，進行體外凝膠遷移(EMSA)實驗。其中，為了進一步確認結果的可靠性和確認USF2和Smurf1/2promoter區(qū)結合的特異性，我們設計了冷

8、探針競爭實驗，即使用不同高濃度的未標記生物素的冷探針和突變冷探針，競爭生物素探針與USF2蛋白的結合。另外我們使用USF2抗體，進行超阻滯實驗，以排除其他基因或非特異性蛋白帶來的影響。
　　 三.USF2對Smur1/2發(fā)揮抑制效應功能區(qū)的研究
　　 將Myc-USF2、Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)轉染到MCF7細胞中，48h后收集并裂解細胞，通過Westernblot及實時

9、定量PCR確定USF2抑制Smurf1/2轉錄水平的具體功能區(qū)域。
　　 研究結果:
　　 一.USF2與其截短體真核表達載體的構建
　　 1.成功構建重組質粒Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。
　　 挑取陽性克隆，提取質粒后進行雙酶切鑒定，將酶切陽性結果送測序，測序正確的重組質粒說明Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)構

10、建成功。
　　 2.轉染真核細胞重組質粒的正確表達
　　 將構建正確的重組質粒轉染細胞，經Westernblot驗證其在真核細胞中能夠正確表達。
　　 二.USF2對Smurf1、Smurf2的功能調控研究
　　 1.Smurf1/2對USF2無調控作用
　　 梯度轉染Flag-Smurf1或Flag-Smurf2，由Westernblot驗證，發(fā)現USF2蛋白水平不隨著Smurf1/2的變化而變

11、化，初步認為USF2不是Smurf1/2的泛素化底物。而后進行的內源性Co-IP實驗證明，和使用NormalIgG抗體的對照組一樣，使用USF2抗體進行IP的實驗組沒有檢測到Smurf1或Smurf2，說明USF2與Smurfs之間無相互作用。
　　 2.USF2對Smurf1/2轉錄有抑制作用
　　 梯度轉染Myc-USF2，Westernblot檢測后發(fā)現Smurf1/2的蛋白水平呈現梯度下降，實時定量PCR檢測發(fā)現

12、Smurf1/2的mRNA水平也下降，說明USF2對Smurfs的蛋白水平和mRNA水平均有抑制作用。敲低細胞內源USF2后則得到相反的效應。為了確證USF2對Smurfs是在轉錄水平還是轉錄后水平發(fā)揮抑制作用，我們構建了含有Smurf1/2promoter區(qū)E-box結構域的PGL3-enhance報告基因，發(fā)現過表達USF2對Smurf1/2轉錄活性具有明顯的抑制作用，敲低反之。雙熒光素酶報告基因實驗證實USF2對Smurf1/2是

13、在轉錄水平發(fā)揮了抑制作用而最終導致其大蛋白水平的降低。
　　 3.USF2結合Smurf1/2啟動子區(qū)
　　 ChIP實驗明確USF2在體內可以結合Smurf1/2的啟動子，證實USF2是Smurf1/2的轉錄因子。純化GST-USF2蛋白，Westernblot并驗證其正確表達。進行體外EMSA實驗，結果得到USF2和Smurf1/2promoter區(qū)結合能夠產生DNA-蛋白復合體，即說明USF2在體外可以直接結合Sm

14、urf1/2的啟動子。使用不同高濃度的冷探針，可以成功競爭生物素探針與USF2蛋白的結合;而使用突變探針后，DNA-蛋白復合體結合條帶消失，從而進一步確證USF2特異的結合Smurf1/2的啟動子。另外，使用USF2抗體進行EMSA超阻滯實，發(fā)現結合條帶遷移明顯滯后。以上說明USF2特異性結合Smurf1/2啟動子區(qū)。
　　 三.USF2對Smur1/2發(fā)揮抑制效應功能區(qū)的研究
　　 轉染Myc-USF2、Myc-USF

15、2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)48h后，Westernblot及實時定量PCR，發(fā)現Myc-USF2、Myc-USF2(236-346aa)對Smurf1/2的蛋白及轉錄水平有抑制作用，而Myc-USF2(1-235aa)不具備抑制效應，說明對Smurf1/2發(fā)揮轉錄抑制的功能區(qū)域主要是USF2的第236到第346氨基酸之間的區(qū)域。
　　 結論及意義:
　　 本研究首次發(fā)現了Smurf1和S