剪接因子hnRNP A1和ASF-SF2對UVB的響應(yīng)及其功能研究.pdf

1、過量紫外線照射是導致皮膚癌發(fā)生的重要原因，其中的發(fā)病機理一直是生物醫(yī)學研究的重點方向。近年來，對于UV照射引起的基因可變剪接的研究越來越得到重視，因為UV照射應(yīng)激下表達的基因變異體對于腫瘤的形成有重要促進作用。其中，mdm2基因作為一種致癌基因，在多種腫瘤中表現(xiàn)出高水平表達，同時，在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了mdm2基因的多種變異體,這些變異體的出現(xiàn)對于腫瘤的發(fā)生有重要的促進作用。并且，有研究證明UVB照射可以有效誘導mdm2基因的可變剪接過程，

2、但是具體的調(diào)控機制仍然不清楚。剪接因子是一類調(diào)控基因可變剪接的重要蛋白，它們可以通過調(diào)節(jié)基因的可變剪接過程產(chǎn)生不同的基因變異體，從而導致細胞生理過程的改變。但是剪接因子是否調(diào)控UVB照射引起的mdm2可變剪接過程還沒有研究報道。本論文以hnRNP A1和ASF/SF2兩個重要的剪接因子為研究對象，用細胞分子生物學方法檢測了剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2在UVB引起的mdm2基因可變剪接過程中的調(diào)節(jié)作用。
　　另外，剪接因

3、子hnRNP A1和ASF/SF2在多種類型的腫瘤中都表現(xiàn)出高表達，被認為是一種促進癌癥的因子，研究兩因子對于UVB照射的響應(yīng)及細胞存活影響可以加深對皮膚癌發(fā)生機理的認識。其中，我們研究了UVB照射劑量和時間對于hnRNP A1和ASF/SF2表達以及細胞定位的影響，也研究了在UVB照射下ROS，p53以及NF-κB和Akt信號通路對于剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2表達的影響，以全面地了解hnRNP A1和ASF/SF2對UV

4、B照射的響應(yīng)及其對腫瘤促進的作用。
　　細胞自噬是UVB照射引起的細胞反應(yīng)，可以促進UVB照射下細胞的存活，并在腫瘤的發(fā)展過程中起重要作用。而目前對于細胞自噬與剪接因子之間關(guān)系的研究還沒有報道，在本論文中，我們試圖探究HaCaT細胞中剪接因子與細胞自噬之間的關(guān)系，以增進剪接因子促癌功能的了解。
　　綜上，本論文主要研究內(nèi)分為三大部分：1.UVB通過剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2調(diào)控mdm2的可變剪接過程;2.剪接因

5、子hnRNP A1和ASF/SF2對于UVB照射下的響應(yīng)及細胞存活的影響；3.hnRNP A1和ASF/SF2與UVB導致的細胞自噬之間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　　①UVB可以促進HaCaT細胞中mdm2基因的可變剪接，促使mdm2B剪接變異體表達量增加，mdm2-FL下調(diào)。
　?、赨VB照射可以促進HaCaT細胞中hnRNP A1和ASF/SF2的表達，其中剪接因子hnRNP A1通過與mdm2 pre-mRNA的直接

6、結(jié)合進而調(diào)控UVB引起的mdm2選擇剪接過程，但是在我們的實驗中，ASF/SF2卻對mdm2的可變剪接過程沒有顯著調(diào)控影響。
　?、踀VB照射引起的HaCaT細胞中hnRNP A1和ASF/SF2的高表達具有時間依賴性，通過免疫熒光和western blot檢測發(fā)現(xiàn)UVB照射后，兩個蛋白可以從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中。
　　④經(jīng)藥物清理ROS，western blot檢測，證明ROS可以抑制UVB引起的剪接因子hnRNP A1和

7、ASF/SF2的上調(diào)；同時，通過瞬時過表達p53，證明p53也是UVB引起的hnRNP A1和ASF/SF2表達的負調(diào)控因子。
　?、萃ㄟ^在細胞培養(yǎng)基中加入抑制劑，用western blot檢測，證明抑制NF-κB與Akt信號通路可以導致hnRNP A1和ASF/SF2的下調(diào)；但是在加入NF-κB抑制劑后再進行UVB照射，仍然可以促進hnRNP A1和ASF/SF2水平的上調(diào)，而加入Akt信號通路抑制劑組再進行UVB處理后hnRN

8、P A1和ASF/SF2水平不再上調(diào)，說明UVB主要通過Akt信號通路調(diào)控hnRNP A1和ASF/SF2的表達。
　　⑥用siRNA將hnRNP A1和ASF/SF2水平沉默后檢測細胞在UVB照射后細胞存活率，證明hnRNP A1和ASF/SF2有促進UVB照射后HaCaT細胞存活的功能。
　?、咄ㄟ^慢病毒構(gòu)建EGFP-LC3B的HaCaT穩(wěn)定細胞株，構(gòu)建了可以通過熒光顯微鏡以及western blot方法檢測的細胞自噬模