端粒結(jié)合因子1對p53和ATM的功能調(diào)控及其機(jī)理研究.pdf

1、端粒是真核生物染色體末端的一段重復(fù)序列，對于保護(hù)染色體的完整性必不可少。哺乳動物端粒長度的動態(tài)平衡是由許多端粒結(jié)合蛋白共同調(diào)控的，其中端粒結(jié)合因子1(Telomere Repeat Binding Factor 1，TRF1)是最重要的端粒結(jié)合蛋白之一。TRF1的過量表達(dá)抑制了端粒酶的作用，縮短了端粒長度，而且RTRF1能和TIN2、POT1和PTOP結(jié)合成蛋白復(fù)合物。TRFl在ANLL細(xì)胞中的表達(dá)明顯減低，而在ALL細(xì)胞中表達(dá)與正常對

2、照比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示TRF1在ANLL和ALL中發(fā)揮不同的調(diào)控作用。 p53是一個重要的抑癌基因，在各種應(yīng)激事件引起DNA損傷時，發(fā)揮細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)凋亡的重要作用。p53基因突變的Li-Fraumeni綜合征患者和p53基因敲除的小鼠發(fā)生惡性腫瘤的概率高達(dá)50％以上。p53的轉(zhuǎn)錄后修飾對于它的激活有重要的作用，例如絲氨酸15位的磷酸化可以促進(jìn)凋亡和調(diào)控G1期檢查點(diǎn)。 ATM(ataxia telangiect

3、isa mutant)是人染色體突變隱性遺傳的毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)癥致病基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控、有絲分裂、端粒長度監(jiān)測及DNA損傷細(xì)胞學(xué)反應(yīng)。 研究報道，ATM蛋白磷酸化TRF1蛋白的219位氨基酸，并能夠抑制TRF1的促凋亡作用。在AS2O3處理的胃癌細(xì)胞中，可以檢測到TRF1、TRF2蛋白含量的增加，引起細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡，同時伴有p53含量的增加，但是具體影響p53蛋白表達(dá)的途徑并不明確。 對胃腸道腫瘤模

4、型小鼠的研究證實了端?？s短對上皮細(xì)胞來源腫瘤的影響。 在大腸癌的癌前病變家族性腺瘤性息肉的病人中發(fā)現(xiàn)了APC腫瘤抑制基因的突變。雜合型APC(APCmin+/-)和APC突變型小鼠均有高比率的胃腸道腺瘤發(fā)生，端粒酶缺失的雜合型APC小鼠腺瘤發(fā)生率顯著低于APC雜合型小鼠，并且p53蛋白水平同時增高。最近的研究證實，端?？s短可以激活p53，引起G1期檢查點(diǎn)被激活及細(xì)胞周期停滯。對TERC-/-成纖維細(xì)胞的研究說明，端粒縮短后激活p

5、53的信號通路涉及到p53對細(xì)胞周期的阻滯。TERC-/-與p21-/-均缺失的小鼠和TERC-/-缺失，但是p53+/+的小鼠相比，腫瘤易感性增強(qiáng)，易患腫瘤類型也發(fā)生了改變。這些實驗結(jié)果也提示，端粒缺失引起的p53激活后，需要p21參與的細(xì)胞周期調(diào)控來抑制腫瘤的生成。在p53活化引起細(xì)胞周期阻滯的人類細(xì)胞中，觀察到p21蛋白水平增高。在人類成纖維細(xì)胞中p21的失活能延長細(xì)胞的存活時間，證明p21確實是一個重要的p53途徑中的信號因子。

6、端粒失活在p53引起的G1期檢查點(diǎn)激活中的作用和信號通路還需要更多的實驗進(jìn)一步的研究。 國際上尚未有人報道p53和TRF1有直接的相互作用。因此，本研究以TRF1對p53和ATM功能調(diào)節(jié)為研究對象，并試圖闡明TRF1在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)途徑中的作用及其作用機(jī)理。 第一部分，TRFl與p53的相互作用。 本課題的研究在國際上首次證明了端粒結(jié)合因子1在體內(nèi)和體外與p53相互作用。用TRF1作為誘餌篩選到了它的相互作用蛋白質(zhì)

7、p53。為了證實TRF1與p53的相互作用，進(jìn)行了GSI pulldown以及免疫共沉淀實驗，驗證了TRF1在體內(nèi)和體外都與p53相互作用。并且TRF1和p53的結(jié)合區(qū)域在p53的C端。在有絲分裂期細(xì)胞中，TRF1和p53都有中心體定位。兩者在中心體上的共定位更進(jìn)一步證實了它們之間的相互作用，也提示了它們參與了中心體的功能。TRF1 siRNA敲除后，p53在有絲分裂期的中心體定位并不消失。說明TRF1對于p53的中心體定位不是必須的。

8、 第二部分，TRF1對p53的作用及其機(jī)理研究。 為了進(jìn)一步闡明TRF1在p53依賴的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和凋亡信號途徑中所發(fā)揮的作用，我們構(gòu)建了p53的模擬磷酸化和非磷酸化狀態(tài)的突變體GFP-p53s150和GFP-p53s15A，并進(jìn)行了免疫共沉淀、免疫印跡和免疫熒光實驗。免疫共沉淀和Pulldown實驗證實了GFP-p53s15A和GFP-p53s15D在體內(nèi)和體外都能和TRF1相互作用。熒光顯微鏡下觀察到UV脅迫后，T

9、RF1和p53S15在U20S細(xì)胞核中有共定位。這些結(jié)果提示了TRF1和p53的穩(wěn)定和絲氨酸15位的磷酸化密切相關(guān)。而且進(jìn)一步的免疫印跡結(jié)果表明TRF1能增強(qiáng)p53絲氨酸15位的磷酸化和p21的蛋白水平。TRF1對p21的直接作用國際上還未見相關(guān)報道，在檢測TRF1對p21基因啟動子活性的影響時，螢火蟲螢光素酶實驗發(fā)現(xiàn)TRF1確實能夠增強(qiáng)p53對p21啟動子的轉(zhuǎn)錄激活活性。綜上所述，實驗結(jié)果證實了TRF1能夠增強(qiáng)p53絲氨酸15位的磷酸

10、化和對CDK抑制因子p21的轉(zhuǎn)錄激活，從而調(diào)控細(xì)胞周期，并行使抑制腫瘤細(xì)胞生長的重要功能。端粒功能失調(diào)和細(xì)胞衰老與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)，以上實驗結(jié)果提示了TRF1通過p53信號途徑影響細(xì)胞周期調(diào)控，并可能進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。 第三部分，TRF1對ATM的作用及其機(jī)理研究。 TRF1 219位絲氨酸是ATM激酶的磷酸化位點(diǎn)，為了進(jìn)一步研究TRF1對細(xì)胞周期調(diào)控的作用，我們構(gòu)建了TRF1的模擬磷酸化

11、和非磷酸化狀態(tài)的突變體GFP-TRF1S219D和GFP-TRF1S219A。測序證實了突變成功，GFP抗體免疫印跡證實了突變體蛋白質(zhì)能夠在真核細(xì)胞中正確表達(dá)。另外熒光顯微鏡下觀察到TRFls219A-GFP和TRF1s219D-GFP均呈點(diǎn)狀定位于細(xì)胞端粒，說明絲氨酸219位的突變并不影響TRF1和端粒的結(jié)合。而且轉(zhuǎn)染野生型和突變體后HeLa細(xì)胞中ATM蛋白含量均比對照組增高。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，過表達(dá)TRF1野生型和非磷酸化突變體的