核仁因子Def對(duì)p53的負(fù)調(diào)控作用及其對(duì)肝臟發(fā)育影響的研究.pdf

1、p53是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子和抑癌因子，其表達(dá)水平需要受到嚴(yán)格的監(jiān)控。由目前已發(fā)表的研究結(jié)果來(lái)看，正常情況下機(jī)體通過(guò)泛素化和26S蛋白酶體降解途徑來(lái)維持體內(nèi)的p53處于低水平。目前已知的核仁因子對(duì)p53的調(diào)控作用也是通過(guò)影響Mdm2介導(dǎo)的泛素化降解途徑實(shí)現(xiàn)的。但至目前為止鮮見(jiàn)關(guān)于非蛋白酶體降解途徑調(diào)控p53蛋白水平的報(bào)道。本課題的研究結(jié)果顯示核仁因子Def通過(guò)半胱氨酸蛋白酶CAPN3而非泛素化-蛋白酶體途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)p53的負(fù)調(diào)控作用。此

2、外，本課題還發(fā)現(xiàn)當(dāng)Def缺失時(shí)，p53會(huì)大量積累于核仁，而CAPN3則是目前唯一被發(fā)現(xiàn)能定位于核仁的半胱氨酸蛋白酶，所以我們的研究很有可能揭示了一個(gè)全新的在核仁進(jìn)行的p53負(fù)調(diào)控途徑。斑馬魚(yú)中capn3有兩個(gè)同源基因，capn3a和capn3b。通過(guò)TALEN方法我們已分別獲得capn3a和capn3b的突變體，這為我們今后研究CAPN3的生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。
　　Def的缺失不但會(huì)引起p53及其異構(gòu)體的積聚，還會(huì)影響包括肝臟在

3、內(nèi)的消化器官的發(fā)育，但是Def過(guò)表達(dá)情況下對(duì)肝臟的影響卻仍未見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)肝臟持續(xù)性過(guò)表達(dá)Def的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(fabp10a:def)做為實(shí)驗(yàn)材料，借助基因芯片檢測(cè)到了Def過(guò)表達(dá)時(shí)對(duì)成魚(yú)肝臟基因表達(dá)譜的影響。我們還發(fā)現(xiàn)Def持續(xù)性的過(guò)表達(dá)會(huì)造成18S rRNA前體的積累，也會(huì)導(dǎo)致成魚(yú)肝臟細(xì)胞形態(tài)的變化甚至出現(xiàn)肝臟腫瘤。所以Def在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)需要控制在特定的范圍，不能太多或者太少。另外，我們也發(fā)現(xiàn)Def通過(guò)細(xì)胞自主性方式發(fā)揮

4、其功能。
　　最后，本課題首次克隆到了一個(gè)新的斑馬魚(yú)p53異構(gòu)體——Δ113bp53，它是已報(bào)道的p53另一個(gè)異構(gòu)體Δ113p53的剪接異構(gòu)體。Δ113p53和Δ113bp53共用一個(gè)啟動(dòng)子并具有相同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，它們的表達(dá)都能被def基因缺失或化學(xué)藥品Camptothecine處理等所誘導(dǎo)，且兩者都有拮抗p53引起的凋亡的作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)Δ113bp53的產(chǎn)生是由于野生型斑馬魚(yú)中天然存在CATT四個(gè)堿基缺失而導(dǎo)致的。有關(guān)

5、Δ113bp53的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步的研究。
　　總結(jié)而言，本課題以模式生物斑馬魚(yú)和人類細(xì)胞系為研究對(duì)象，綜合運(yùn)用分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等方法深入研究了核仁蛋白Def對(duì)p53的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)了核仁中存在以Def-CAPN3為軸線蛋白降解新途徑，且發(fā)現(xiàn)該途徑在維持p53在核仁中的穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用，同時(shí)本課題也鑒定了p53新的異構(gòu)體。這些研究結(jié)果不僅加深了我們對(duì)核仁生物學(xué)功能的理解，補(bǔ)充了p53功能的研究，也為認(rèn)識(shí)核