三羥異黃酮調(diào)控APE1和p53交互作用對A549細(xì)胞的影響研究.pdf

1、研究背景:
　　肺癌的發(fā)生率與死亡率均占惡性腫瘤首位,其中80~85％為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。目前以手術(shù)、放療、化療和靶向治療為主的肺癌綜合治療療效仍然欠佳,進(jìn)一步提高NSCLC療效是當(dāng)前腫瘤學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。氧化應(yīng)激與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切,研究表明脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶( apurinic/apyrimidinic endonuclease, Ape1/Ref-1)和

2、wtp53作為眾多的氧化應(yīng)激因子之一具有突出作用。Ape1/Ref-1是一種獨(dú)特的DNA損傷修復(fù)、氧化還原和參與RNA代謝的多功能蛋白,除了與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)外,它還涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等多種關(guān)鍵細(xì)胞功能,其表達(dá)升高能明顯增加 NSCLC的放射敏感性從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。抑癌基因p53作為“基因衛(wèi)士”能編碼序列特異性轉(zhuǎn)錄因子,從而誘導(dǎo)細(xì)胞逃逸和凋亡,維持細(xì)胞周期完整、DNA損傷修復(fù)和基因的穩(wěn)定性。三羥異黃酮(genistein,

3、 GEN)是大豆中的主要異黃酮成分,研究報(bào)道其能有效降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的Ape1/Ref-1蛋白表達(dá)卻上調(diào)野生型p53蛋白表達(dá)。目前研究發(fā)現(xiàn)野生型p53作為Ape1/Ref-1的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié)因子,可以抑制Ape1/Ref-1蛋白的表達(dá),而Ape1/Ref-1可通過氧化還原依賴和氧化還原非依賴兩條途徑調(diào)節(jié)p53蛋白的DNA結(jié)合活性,從而促進(jìn)下游p21,BAX,Bcl-2等凋亡基因的轉(zhuǎn)錄激活。故Ape1/Ref-1和p53交互作用可能是三羥異黃

4、酮介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌放療增敏的重要核心事件。然而,Ape1/Ref-1和p53不僅具有相互調(diào)控作用,在肺腺癌和宮頸癌細(xì)胞中還存在內(nèi)源性和外源性結(jié)合作用,故研究并闡明二者的結(jié)合情況及其機(jī)制以及三羥異黃酮介導(dǎo)Ape1/Ref-1和p53相互調(diào)控作用對A549細(xì)胞放療的影響及機(jī)制,對以Ape1/Ref-1為靶分子的三羥異黃酮增敏肺癌放射治療研究,探討與腫瘤放化療抵抗之間的關(guān)系進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究目的:
　　1.研究三羥異黃

5、酮(genistein, GEN)下調(diào)肺腺癌 A549細(xì)胞 Ape1/ Ref-1(apurinic/apyrimidinic endonuclease1/redox factor-1)、上調(diào)p53表達(dá)以及三羥異黃酮對A549細(xì)胞增殖凋亡的作用,探討三羥異黃酮調(diào)節(jié)Ape1/Ref-1和p53交互作用對肺癌放療的影響及機(jī)制,為以Ape1/Ref-1為靶分子的三羥異黃酮增敏肺癌放射治療轉(zhuǎn)化研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2.研究Ape1/Re

6、f-1(apurinic/apyrimidinic endonuclease1/redox factor-1)和p53蛋白相互結(jié)合及結(jié)合的分子機(jī)制,從而進(jìn)一步探討相互間轉(zhuǎn)錄調(diào)控與腫瘤放化療抵抗的關(guān)系并奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.三羥異黃酮(genistein,GEN)單獨(dú)及聯(lián)合放療對A549細(xì)胞增殖凋亡的影響觀察:細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度三羥異黃酮單獨(dú)作用 A549細(xì)胞不同時間,細(xì)胞的生長抑制情況;錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)

7、三羥異黃酮和放療聯(lián)合或不聯(lián)合處理 A549細(xì)胞后第2-6天的存活數(shù)量。
　　2.三羥異黃酮調(diào)節(jié) Ape1/Ref-1和p53蛋白表達(dá)對三羥異黃酮單獨(dú)及聯(lián)合放療促進(jìn)A549細(xì)胞照射后凋亡的影響觀察:Western blot檢測不同濃度三羥異黃酮單獨(dú)作用A549細(xì)胞不同時間,三羥異黃酮單獨(dú)及聯(lián)合放療作用 A549細(xì)胞后, Ape1/Ref-1蛋白和p53蛋白的表達(dá)。
　　3.Ape1/Ref-1和p53的相互調(diào)控作用:共轉(zhuǎn)染Ap

8、e1/Ref-1啟動子熒光報(bào)告基因載體和不同量WTp53表達(dá)質(zhì)粒于A549細(xì)胞,Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)Ape1/Ref-1表達(dá),雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測野生型p53對Ape1/Ref-1啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié);EMSA實(shí)驗(yàn)觀察p53蛋白的DNA結(jié)合活性在三羥異黃酮的作用下的變化。
　　4.Ape1/Ref-1和p53內(nèi)源性和外源性結(jié)合作用的研究探討:免疫共沉淀和GST-pull down沉降試驗(yàn)觀察Ape1/Re

9、f-1蛋白和p53蛋白的內(nèi)源性和外源性結(jié)合情況,同時免疫熒光觀察過氧化氫處理或不處理?xiàng)l件下,細(xì)胞中Ape1/Ref-1和p53蛋白的亞細(xì)胞共定位情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.三羥異黃酮(genistein,GEN)單獨(dú)及聯(lián)合放療對 A549細(xì)胞增殖凋亡的觀察:細(xì)胞生存實(shí)驗(yàn)(MTT)結(jié)果顯示三羥異黃酮單獨(dú)及聯(lián)合放療對 A549細(xì)胞增殖抑制率呈劑量和時間依賴性,即三羥異黃酮抑制放療照射后 A549細(xì)胞的增殖存活,且濃度越高,作

10、用時間越長,增殖抑制率越高;錐蟲藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)分別計(jì)數(shù)對照組,單純藥物組,單純照射組,藥物聯(lián)合照射組,A549細(xì)胞第2-6天的存活細(xì)胞數(shù)顯示三羥異黃酮聯(lián)合放療明顯抑制A549細(xì)胞生長。
　　2.三羥異黃酮調(diào)節(jié) Ape1/Ref-1和p53蛋白表達(dá)對三羥異黃酮單獨(dú)及聯(lián)合放療促進(jìn)A549細(xì)胞照射后凋亡的影響觀察:三羥異黃酮下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ape1/Ref-1蛋白,上調(diào)p53蛋白具有濃度和時間依賴性,即隨著三羥異黃酮作用濃度遞增,作用時間

11、延長, Ape1/Ref-1蛋白表達(dá)逐漸減弱,p53蛋白表達(dá)逐漸增加。放療照射細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ape1/Ref-1和p53蛋白表達(dá)上調(diào),三羥異黃酮下調(diào)放療誘導(dǎo)的Ape1/Ref-1蛋白表達(dá),卻協(xié)同促進(jìn)照射后胞內(nèi)p53蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　3.Ape1/Ref-1和p53相互調(diào)控作用的研究探討:共轉(zhuǎn)染Ape1/Ref-1啟動子熒光報(bào)告基因載體(-184/+65APE1-Luc)和不同量野生型p53(WTp53)過表達(dá)質(zhì)粒于A549細(xì)

12、胞,隨WTp53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的遞增,胞內(nèi)Ape1/Ref-1蛋白表達(dá)逐漸降低。且野生型p53對Ape1/Ref-1啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用隨p53表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的遞增逐漸增強(qiáng),故 WTp53可能通過抑制 Ape1/Ref-1啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性從而下調(diào) A549細(xì)胞內(nèi)Ape1/Ref-1蛋白的表達(dá)水平。EMSA結(jié)果顯示三羥異黃酮提高A549細(xì)胞p53蛋白的DNA結(jié)合活性,進(jìn)而刺激下游基因的表達(dá)。
　　4.Ape1/Ref-1和 p5

13、3內(nèi)源性和外源性結(jié)合情況的研究:免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ape1/Ref-1和p53兩蛋白存在內(nèi)源性結(jié)合,GST-pull down沉降試驗(yàn)證實(shí)二者存在外源性結(jié)合作用。免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察過氧化氫(TBHP)在處理或不處理?xiàng)l件下,Ape1/Ref-1和p53蛋白的形態(tài)學(xué)共定位,結(jié)果顯示其亞細(xì)胞定位為核漿共定位,但主要分布在胞核,少量在胞漿。
　　結(jié)論:
　　1.三羥異黃酮抑制肺腺癌A549細(xì)胞生長,對放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用;三羥

14、異黃酮下調(diào)Ape1/Ref-1蛋白表達(dá)上調(diào)p53蛋白表達(dá)具有時間和濃度依賴性,其聯(lián)合放療可以抑制照射誘導(dǎo)的 Ape1/Ref-1蛋白表達(dá)增高,進(jìn)一步促進(jìn)放療照射誘導(dǎo)的p53蛋白表達(dá)。野生型 p53可能通過抑制 Ape1/Ref-1啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性從而下調(diào)A549細(xì)胞內(nèi)Ape1/Ref-1蛋白的表達(dá)水平。三羥異黃酮促進(jìn)p53蛋白的DNA結(jié)合活性。為探討三羥異黃酮調(diào)節(jié)Ape1/Ref-1和p53交互作用對肺癌放療的影響及機(jī)制,進(jìn)行以Ape