MDMX通過(guò)與p53蛋白的二次作用抑制p53DNA結(jié)合功能的分子機(jī)制.pdf

1、背景：
　　p53作為腫瘤抑癌蛋白，直接參與了細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)以及細(xì)胞凋亡、衰老等不同損傷或應(yīng)激的反應(yīng)過(guò)程。此過(guò)程中 p53蛋白具有兩個(gè)重要的調(diào)節(jié)蛋白—MDM2和MDMX。其中，MDM2能夠通過(guò)其C末端的E3連接酶降解p53蛋白。而MDMX蛋白雖然與MDM2的泛素E3連接酶序列同源，但是MDMX對(duì)p53蛋白的調(diào)節(jié)作用是具有唯一性的。通過(guò)純化MDMX蛋白鑒定出的高親和力分子伴侶—CK1α，可以和MDMX蛋白的中間區(qū)域相結(jié)

2、合并促進(jìn)MDMX-p53蛋白之間的相互作用?；贛DMX能夠與p53蛋白在細(xì)胞核內(nèi)共定位，并調(diào)節(jié)p53功能，本文擬探索MDMX對(duì)于p53蛋白的非降解性調(diào)節(jié)機(jī)制以及對(duì)于p53 DNA結(jié)合功能是否具有抑制作用，并在此過(guò)程中分子伴侶CK1α是否發(fā)揮了其協(xié)同作用。
　　方法：
　　1.DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)：首先將FLAG-MDMX或者CK1α-MDMX與p53復(fù)合物轉(zhuǎn)染至 H1299腫瘤細(xì)胞系內(nèi)，其次用 M2瓊脂糖珠子純化FLAG-MDM

3、X/CK1α-MDMX-p53復(fù)合物，然后與含有p53結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段相孵育，細(xì)胞體外證明是否FLAG-MDMX/MDMX-P53復(fù)合物與DNA片段相結(jié)合。
　　2.應(yīng)用PONDR方法預(yù)測(cè)MDMX分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部無(wú)序區(qū)域并選擇酶切位點(diǎn)位置，插入三個(gè)不同的抗原表位標(biāo)簽（FLAG，MYC和HA），從而構(gòu)建MDMXc3新的質(zhì)粒用于下一步實(shí)驗(yàn)。
　　3.蛋白片段釋放實(shí)驗(yàn)（Proteolytic fragment release，PF

4、R）：將MDMXc3細(xì)胞過(guò)表達(dá)于H1299細(xì)胞系與GST-p53相孵育，然后用特異性抗體固定裂解的細(xì)胞內(nèi)蛋白，用PreScission蛋白酶切除復(fù)合物后，如果蛋白片段相結(jié)合則被固定在瓊脂糖珠子上，而沒(méi)有結(jié)合的蛋白片段則釋放到上清液中。應(yīng)用這種新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，我們進(jìn)一步研究了MDMX與p53分子間的相互作用以及CK1α能否協(xié)同促進(jìn)MDMX與p53之間相互作用的分子機(jī)制。
　　4.細(xì)胞體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在敲除A549，JEG-3，MCF-7以

5、及U2OS四個(gè)腫瘤細(xì)胞系內(nèi)MDMX或者 CK1α，應(yīng)用 Western blot以及染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，CHIP)探查MDMX與CK1α能否協(xié)同抑制p21蛋白的表達(dá)以及p53與目的基因p21啟動(dòng)子的相互結(jié)合；進(jìn)一步在IPTG誘導(dǎo)NARF細(xì)胞后穩(wěn)定表達(dá)ARF以及在伽馬放射線（IR）的作用下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)p53蛋白及其目的蛋白 p21，應(yīng)用 Western blot以及染色

6、質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)MDMX或者 MDMX-367A是否能夠抑制目的蛋白 p21；我們創(chuàng)建穩(wěn)定表達(dá)MDMX以及 MDMX-367A的U2OS腫瘤細(xì)胞系，內(nèi)源性敲除 CK1α后，應(yīng)用Western blot以及染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)研究是否 CK1α參與了MDMX或者M(jìn)DMX-367A抑制p53 DNA結(jié)合功能的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1. DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，CK1α-MDMX-p53三種蛋白復(fù)合物能夠有效抑制p53蛋白的

7、序列特異性DNA結(jié)合活性；MDMX-367A與CK1α相結(jié)合后也能夠明顯抑制p53蛋白與序列特異性DNA相結(jié)合，而289位點(diǎn)突變后的MDMX無(wú)法被CK1α磷酸化從而不能發(fā)揮抑制p53蛋白的DNA結(jié)合功能的作用。因此實(shí)驗(yàn)說(shuō)明p53蛋白的DNA結(jié)合功能被抑制，需要MDMX和CK1α相互協(xié)作，以及CK1α對(duì)于MDMX289位點(diǎn)的磷酸化。
　　2.創(chuàng)建可酶切的MDMXc3質(zhì)粒用于一種新的實(shí)驗(yàn)方法——蛋白片段釋放實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果表明在MDMX-

8、p53復(fù)合物中，MDMX的p53結(jié)合域（N端）與p53 N端初始結(jié)合后，MDMX的酸性結(jié)構(gòu)域和RING結(jié)構(gòu)域能夠二次結(jié)合到p53蛋白上并形成穩(wěn)定的復(fù)合物，而MDMX的RING結(jié)構(gòu)域與p53蛋白的結(jié)合強(qiáng)度明顯高于其N端之間的相互結(jié)合。
　　3.蛋白片段釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明MDMXc3的酸性結(jié)構(gòu)域與RING結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定結(jié)合到 p53的核心結(jié)構(gòu)域上。并進(jìn)一步研究位于 MDMXc3的酸性結(jié)構(gòu)域上的W200S/W201G突變體發(fā)現(xiàn)突變體的酸性結(jié)

9、構(gòu)域與p53蛋白的結(jié)合減弱，而RING結(jié)構(gòu)域依然與p53蛋白結(jié)合力很強(qiáng)，說(shuō)明酸性結(jié)構(gòu)域與RING結(jié)構(gòu)域是結(jié)合到p53蛋白核心結(jié)構(gòu)域的不同位點(diǎn)上。
　　4.與CK1α-136N-MDMXc3-p53以及CK1α-MDMXc3-289A-p53兩種三聯(lián)復(fù)合物的陰性對(duì)照結(jié)果相比，蛋白片段實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明CK1α能夠促進(jìn)MDMX的酸性結(jié)構(gòu)域與p53蛋白的相互作用，并穩(wěn)定兩種蛋白之間的相互結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MDMX的RING結(jié)構(gòu)域不僅能夠增

10、加MDMX與p53蛋白之間相互作用的穩(wěn)定性，而且可以使得p53蛋白活性失活。
　　5.四種不同腫瘤細(xì)胞系體內(nèi)敲除 CK1α或者 MDMX，我們發(fā)現(xiàn) MDMX或者CK1α缺失后都會(huì)增加p53目的蛋白p21的表達(dá)以及p53與目的基因p21啟動(dòng)子的結(jié)合，但是并不影響 p53蛋白的穩(wěn)定性；NARF細(xì)胞被 IPTG誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)ARF或者經(jīng)過(guò)伽馬放射線作用后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部能夠穩(wěn)定p53及其目的蛋白p21的表達(dá)，在這個(gè)背景下轉(zhuǎn)染野生型 MDMX

11、或者突變型 MDMX-367A可以進(jìn)一步抑制p21的表達(dá)以及p53與p21基因啟動(dòng)子的結(jié)合；我們敲除U2OS穩(wěn)定表達(dá)MDMX或MDMX-367A細(xì)胞內(nèi)源性CK1α之后，發(fā)現(xiàn)MDMX與p53之間的結(jié)合減弱。在伽馬放射線誘導(dǎo) p53目的蛋白 p21表達(dá)背景下，仍然敲除內(nèi)源性CK1α，MDMX或MDMX-367A對(duì)p21的表達(dá)以及與p21基因啟動(dòng)子結(jié)合的抑制活性被部分反轉(zhuǎn)，說(shuō)明MDMX或MDMX-367A抑制p53蛋白活性需要CK1α的參與。