利用納米金探針檢測p53蛋白.pdf

1、腫瘤標(biāo)志物檢測是腫瘤普查、診斷和預(yù)后的主要技術(shù)手段之一。p53蛋白是最常用的主要腫瘤標(biāo)志物之一。目前主要通過免疫組織化學(xué)法(IHC)或酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)方法檢測血清中p53抗體的含量，以進行腫瘤普查、診斷和預(yù)后。由于血清p53蛋白含量極低，目前還不能利用上述方法測定p53蛋白。在本項研究中，首先利用標(biāo)記了p53捕捉抗體的納米磁珠來富集并且分離血清中的p53蛋白，然后利用標(biāo)記了p53檢測抗體和HRP(horseradish per

2、oxidase)的納米金探針檢測已經(jīng)富集的p53蛋白。此外，本研究還探討了結(jié)合使用蛋白芯片和納米金探針技術(shù)來檢測多種腫瘤標(biāo)志物的可能，以建立集樣品制備、生化反應(yīng)到分析檢測于一體的微型全分析系統(tǒng)，從而同時對一個樣本進行多種蛋白檢測分析。
　　 1標(biāo)記p53捕捉抗體后納米磁珠表征
　　 熒光顯微鏡觀察表明，p53抗體己成功標(biāo)記到納米磁珠顆粒表面，并且納米磁珠表面的p53抗體與p53蛋白結(jié)合能力良好。透射電子顯微鏡(TEM)掃

3、描結(jié)果進一步表明，p53抗體一納米磁珠外觀為球形、粒徑分布均勻、分散性良好、具有較強的磁響應(yīng)性。
　　 2納米金探針制備
　　 利用檸檬酸三鈉還原法制備的納米金。TEM檢測結(jié)果表明，所制備的納米金顆粒分散性良好、大小均勻，粒徑約10nm。進一步標(biāo)記p53捕捉抗體和辣根逗氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)后，納米金顆粒周圍有一圈清晰可見的“暈”環(huán)，與未標(biāo)記的納米金顆粒周圍清晰的界面成鮮明對比。

4、納米金的紫外一可見光譜最大吸收峰從520nm轉(zhuǎn)移到524nm（IgG-Au-HRP探針）和526 nm(IgG-Au-DNA-HRP探針)。上述結(jié)果表明，納米金、p53捕捉抗體和HRP形成了復(fù)合物。
　　 3納米金探針制備條件優(yōu)化
　　 根據(jù)制備溶液pH和p53檢測抗體用量對納米金探針穩(wěn)定性和檢測靈敏度的影響，我們確定最適pH值為9.0，100 uL納米金溶液中適宜加入0.25 uL檢測抗體。通過p53蛋白檢測效果對Ig

5、G-Au-HRP和IgG-Au-DNA-HRP探針制備條件進行進一步優(yōu)化。結(jié)果表明，在制備IgG-Au-HRP探針時，HRP分子和p53抗體的最佳比例為10:1；在制備IgG-Au-DNA-HRP探針時，DNA和p53抗體的最佳比例為2.5:1。HRP分子定量檢測顯示，一個IgG-Au-HRP探針可標(biāo)記HRP數(shù)量約11個，IgG-Au-DNA-HRP探針可標(biāo)記HRP數(shù)量為20個。
　　 4利用磁珠探針和納米金探針檢測p53蛋白<

6、br>　　 樣品中p53蛋白（抗原）分別與磁珠探針的捕捉抗體和納米金探針的檢測抗體發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)形成“三明治”夾心結(jié)構(gòu)，通過檢測HRP活性變化來定量檢測樣品p53蛋白含量。該檢測過程可以在2 h里完成。靈敏度分別為0.03ng/mL(IgG-Au-DNA-HRP)和0.055 ng/mL(IgG-Au-HRP)，都顯著優(yōu)于ELISA的檢測靈敏度。
　　 5納米金探針結(jié)合蛋白芯片檢測p53、CEA、NSE蛋白
　　 待

7、測p53、癌胚抗原(care inoembryonie antigen，CEA)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)分別與蛋白芯片表面的各自捕捉抗體特異結(jié)合，再與加入納米金探針表面的檢測抗體特異結(jié)合，完成對樣品中抗原.抗體復(fù)合物染色。最后應(yīng)用芯片掃描儀對光學(xué)信號的灰度值進行分析，進行多蛋白含量檢測。結(jié)果表明該方法可應(yīng)用于多種蛋白聯(lián)合檢測。
　　 以上研究結(jié)果表明：根據(jù)納米金探針和磁珠探