納米磷酸鈣介導(dǎo)p53基因抑癌效果的研究.pdf

1、基因治療是將目的基因整合到基因載體上，通過轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞表達(dá)目的蛋白實(shí)現(xiàn)抑癌效果的治療方法。目前，選擇合適的基因載體是實(shí)現(xiàn)抑癌效果的關(guān)鍵因素之一。本論文采用納米羥基磷灰石(HAp)用作基因載體，研究納米HAp的形狀、粒徑對(duì)其攜載pEGFP-C1-p53后（簡稱:HAp-p53）體內(nèi)外抑癌效果的影響。采用活體成像和透射電鏡(TEM)技術(shù)研究了不同形狀、粒徑的納米HAp在體內(nèi)的分布、降解以及腫瘤靶向性。研究證實(shí)球形納米羥基磷灰石(S-HAp)有

2、良好的抑癌效果，具有腫瘤靶向性。本論文為納米HAp作為基因載體用于癌癥治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為研究無機(jī)納米顆粒在體內(nèi)的分布與代謝提供新方法。
　　方法:
　　1)制備不同形狀、粒徑的納米HAp，研究溫度、pH對(duì)其形狀、粒徑等性質(zhì)的影響，通過場發(fā)射掃描電鏡(SE-FEM)、透射電鏡(TEM)、X射線衍射(XRD)、傅里葉紅外光譜(FTIR)以及粒徑分析儀等表征技術(shù)分析制備的HAp的理化性質(zhì)，建立穩(wěn)定制備納米HAp的方法。

3、>　　2)采用1％瓊脂糖凝膠電泳的方法研究了不同形狀、粒徑對(duì)納米HAp攜載pEGFP-C1-p53(pDNA)量的影響作用，研究不同溫度(37℃、4℃)對(duì)納米HAp攜載pDNA的影響。
　　3)通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)，比較PEI修飾前后對(duì)納米HAp攜載pEGFP-C1（簡稱:HAp-pEGFP，HAp-PEI-pEGFP）對(duì)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的差異。
　　4)通過MTT法檢測納米HAp和

4、HAp-PEI攜載pEGFP-C1-p53（簡稱:HAp-p53，HAp-PEI-p53）體外殺傷癌細(xì)胞的能力及對(duì)正常細(xì)胞的毒性;采用Hocehst33348染色和Westernblot研究其抑癌機(jī)理。
　　5)構(gòu)建BalB/C小鼠乳腺癌4T1/luc移植瘤模型，研究四種HAp-PEI-p53的體內(nèi)抗癌效果。通過測量腫瘤體積、小鼠存活率研究四種HAp-PEI-p53的抑癌效果和生物安全性;采用活體成像技術(shù)(IVIS)深入分析并比較

5、四種HAp-PEI-p53處理后小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移情況，并通過腫瘤組織切片HE染色、P53蛋白免疫組化(P53IHC)、DNA斷裂3'OH原位雜交實(shí)驗(yàn)(TUNEL)和透射電鏡(TEM)等技術(shù)分析HAp-PEI-p53的抑癌機(jī)理。
　　6)采用近紅外熒光染料DiR標(biāo)記納米HAp。通過尾部靜脈將標(biāo)記的納米HAp注射到ICR小鼠體內(nèi)。采用IVIS和TEM分析不同性質(zhì)的納米HAp在體內(nèi)的分布;觀察S-HAp在體內(nèi)的降解和腫瘤靶向性等代謝信息。

6、
　　結(jié)果:
　　1)通過添加不同的有機(jī)基質(zhì)，控制pH、反應(yīng)溫度等條件合成了四種形狀的的納米HAp，分別為:球形納米HAp(S-HAp)，針狀納米HAp(N-HAp)，棒狀納米HAp（R-HAp）和短棒狀納米HAp(SR-HAp)，其平均粒徑為:100nm、200nm、50nm和40nm。
　　2)不同形狀的納米HAp攜載pEGFP-C1-p53(p53)量有明顯差異，等濃度、體積條件下，S-HAp和N-HAp攜載pD

7、NA的能力更強(qiáng);同時(shí)低溫處理可提高HAp攜載pDNA的效率。
　　3)S-HAp、N-HAp、R-HAp和SR-HAp的轉(zhuǎn)染效率約為1％，而S-HAp-PEI，N-HAp-PEI、R-HAp-PEI和SR-HAp-PEI轉(zhuǎn)染效率分別為13.0％、14.6％、9.5％和15.5％，顯示PEI修飾可顯著提高載體的轉(zhuǎn)染效率。
　　4)體外抑癌實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HAp-p53無明顯抑癌效果，而經(jīng)PEI修飾后的HAp可有效殺傷Hep-3B、H

8、uH-7和Bel-7404等多種癌細(xì)胞，并且HAp-PEI本身具有良好的生物相容性。
　　5)HAp-PEI-p53能有效抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，可延長荷瘤小鼠的生命。其中N-HAp抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果最佳，S-HAp次之，而R-HAp和SR-HAp對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制效果較弱。
　　6)粒徑為40-200nm之間的S-HAp、N-HAp、R-HAp和SR-HAp的納米顆粒僅分布在肝臟中，在小鼠體內(nèi)的降解周期約為3周，且顆粒具有腫瘤