納米羥基磷灰石負(fù)載p53基因及阿霉素對(duì)肝癌干細(xì)胞抑制效果研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，以其高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移率，成為死亡率居全球第三的疾病。腫瘤干細(xì)胞(cancer stemcells，C.SCs)是腫瘤起始、演進(jìn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的根源。而目前癌癥的治療手段都是針對(duì)普通腫瘤細(xì)胞，需尋求一種殺傷腫瘤干細(xì)胞的有效療法，達(dá)到腫瘤根治的目的?；蛑委熤谐２捎玫膒53是細(xì)胞周期調(diào)控的重要基因，能誘使基因突變或損傷的細(xì)胞發(fā)生凋亡。多種腫瘤的發(fā)生伴隨

2、著p53基因的突變，并與CSCs低分化特性相關(guān)。阿霉素是一種廣譜性化療藥物，能插入DNA，使其發(fā)生錯(cuò)配而阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。但除了其無特異性對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性外，阿霉素因CSCs的多藥耐藥性使其無法進(jìn)入CSCs細(xì)胞發(fā)揮藥效。納米材料因其獨(dú)特尺寸、電荷、表面化學(xué)作為基因和藥物載體用于殺傷CSCs的研究已受到廣泛關(guān)注。納米材料作為藥物載體能克服腫瘤多藥耐藥，同時(shí)減少藥物對(duì)正常組織的毒副作用。而羥基磷灰石(hydroxyapati

3、te，HAp)是脊椎動(dòng)物牙齒和骨骼的主要成分，其表面帶正電，使其能通過靜電吸附與帶負(fù)電荷的基因結(jié)合。除了具備納米材料的共性外，優(yōu)越的生物相容性和生物降解性是其作為基因和藥物載體又一優(yōu)勢。HAp負(fù)載p53基因和Dox具有巨大潛能改善腫瘤治療現(xiàn)狀。
　　方法:
　　1.用兩種不同體系制備方法制備納米HAp-1和HAp-2，通過場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)、X射線衍射(XRD)、傅里葉紅外光譜(FTIR)、熱失重分析(TG)等方

4、法對(duì)兩種方法制備的納米HAp粒徑、顆粒形貌、和結(jié)晶度等性質(zhì)進(jìn)行表征。并用聚醚酰亞胺(Polyetherimide，PEI)對(duì)其進(jìn)行修飾。
　　2.對(duì)PEI修飾的HAp復(fù)合物進(jìn)行生物相容性、對(duì)p53基因與阿霉素的負(fù)載效率和降解性能進(jìn)行評(píng)估。
　　3.用MTT法、克隆形成和hoechst33258染色等方法綜合評(píng)估HP-p53-Dox對(duì)采用無血清培養(yǎng)基體外懸浮培養(yǎng)法所富集的肝癌CSCs殺傷效果。
　　結(jié)果:
　　1.

5、采用化學(xué)沉淀法通過PEG調(diào)控，經(jīng)PEI修飾后，得到HP-1和HP-2。采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡、傅立葉紅外光譜、X射線衍射和熱重分析對(duì)其進(jìn)行表征和分析，得出的HP-1和HP-2的主要成分和晶型都為羥基磷灰石，HP-1為短棒狀，長徑為20-50 nm，短徑約為20 nm; HP-2為球形納米顆粒，粒徑在30 nm左右。
　　2.兩種反應(yīng)體系所制備的納米羥基磷灰石顆粒以及經(jīng)PEI修飾的HP均有良好的生物相容性，對(duì)肝正常細(xì)胞L-02和肝

6、癌細(xì)胞Huh-7、Hep-3B以及乳腺癌MCF-7細(xì)胞皆無明顯細(xì)胞毒性。在對(duì)p53基因負(fù)載研究中發(fā)現(xiàn)，HP-1具有更高的負(fù)載量。HP-p53對(duì)阿霉素的負(fù)載量隨阿霉素濃度升高而增加。在降解實(shí)驗(yàn)中HP-1表現(xiàn)出優(yōu)越的可降解性能，在pH為5.6、6.5、7.4 PBS中90天降解率分別為78％、60％和54％。
　　3.HP-p53-Dox處理后的肝癌CSCs存活率顯著下降，克隆形成率也明顯降低。用Hoechst33258染色觀察到HP