穿膜肽修飾的納米明膠硅氧烷負(fù)載p53對肝癌抑制效果.pdf

1、目的：
　　目前基因治療的最大挑戰(zhàn)仍然是高效、安全的基因載體和治療基因的選擇。明膠硅氧烷納米顆粒(GS NPs)具有低毒性，表面易修飾，易于重復(fù)合成等優(yōu)點(diǎn)，由于其表面帶有較大量的正電荷，可作為一種潛在的基因載體材料，介導(dǎo)目的基因進(jìn)入細(xì)胞并轉(zhuǎn)染。作為一種非病毒基因載體，其低轉(zhuǎn)染效率是制約因素。本課題通過將細(xì)胞穿膜肽Tat修飾到GS NPs表面從而提高轉(zhuǎn)染效率。Tat是一段取自人類免疫性缺陷病毒1(HIV-1)蛋白中的48-62位氨基

2、酸序列(KYGRRRQRRKKRGC)的多肽，含有一定的核定位序列，可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和DNA進(jìn)入細(xì)胞核區(qū)域，并能促進(jìn)細(xì)胞對多種材料的內(nèi)吞效率。此外，p53作為一種抑癌基因，在正常情況下發(fā)揮監(jiān)測作用，參與細(xì)胞對DNA損傷的應(yīng)答，與細(xì)胞周期、凋亡和分化有關(guān)。因此采用溶膠-凝膠法合成GS NPs，并通過Tat共價(jià)修飾，攜載p53基因?qū)Ω伟┑囊种菩Ч潜菊n題的主要研究方向。
　　方法:
　　1）合成納米明膠硅氧烷，以Tat共價(jià)連接修飾得

3、到Tat-GS NPs，通過場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)、透射電鏡(TEM)、動(dòng)態(tài)光散射粒徑分析(DLS)、表面Zeta電位檢測、傅立葉變換紅外光譜(FTIR)、熱重分析儀(TG)等表征方式對其修飾前后的形貌、粒徑、表面電位、結(jié)構(gòu)組成、有機(jī)物含量等進(jìn)行分析比較。
　　2)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測GS NPs和Tat-GS NPs對pEGFP-C1-p53(pDNA)的包封率、釋放性、復(fù)合物穩(wěn)定性進(jìn)行研究，并通過粒徑和電位分析選取進(jìn)入細(xì)胞

4、的較合適的負(fù)載量比。
　　3)評價(jià)Tat修飾前后納米顆粒的生物相容性;體外轉(zhuǎn)染熒光觀察評價(jià)其作為基因載體的可行性，并進(jìn)一步探討納米粒子進(jìn)入細(xì)胞情況和逃逸溶酶體情況。
　　4)MTT法檢測GS NPs、Tat-GS NPs攜載p53對肝癌的抑制效果。Hoechst33258凋亡細(xì)胞染色和Western blot實(shí)驗(yàn)研究其抑癌機(jī)理。
　　結(jié)果與結(jié)論:
　　1)制備的明膠硅氧烷納米顆粒及Tat修飾后（簡稱Tat-GS）

5、呈不規(guī)則球狀，Tat-GS出現(xiàn)聚集傾向，平均粒徑為289nm相比于250nm的GS，有所增大。GS、Tat-GS的表面電位分別為38mV和35mV。
　　2)Tat修飾后對pDNA的包封率降低，Tat-GS/p53在質(zhì)量比為100∶1時(shí)才能實(shí)現(xiàn)完全包裹，而GS/p53在質(zhì)量比30∶1下就能完全包裹。但Tat的修飾對其釋放性和穩(wěn)定性基本無影響。且通過粒徑、電位分析表明納米粒子和pDNA在質(zhì)量比為200∶1時(shí)合成的復(fù)合物粒徑較小，表面

6、呈一定的正電位，有利于細(xì)胞的胞吞進(jìn)入，因此后續(xù)納米復(fù)合物均采用200∶1質(zhì)量比合成。
　　3)毒性實(shí)驗(yàn)表明GS具有良好的生物相容性，且Tat的修飾幾乎對毒性無影響，生物安全性較高，且對pDNA的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明Tat-GS具有較高的轉(zhuǎn)染效率，其原因是Tat作為一種穿膜肽，具有增強(qiáng)載體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的能力和逃逸溶酶體的能力。
　　4)Tat-GS-p53對肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制效果，其抑癌作用可能是由介導(dǎo)p53蛋白的表達(dá)，引起細(xì)胞