MDM2、p53和SUMO-1影響肝癌細胞凋亡的機理研究.pdf

1、第一部分:原發(fā)性肝癌MDM2基因表達與p53基因突變及腫瘤侵襲性的關系 目的:以原發(fā)性肝癌中MDM2基因表達為指標，探討其與p53基因突變和腫瘤侵襲性有關的分子機理。 方法:應用RT-PCR方法，總結本院72例原發(fā)性肝癌和65例相應癌旁肝組織中MDM2的基因表達，研究其與p53基因突變和腫瘤侵襲性之間的關系。 結果:肝癌組織中MDM2基因表達值(50.17±5.23)％明顯高于癌旁肝組織(27.69±7.42)％

2、(P＜0.01)，侵襲性肝癌(59.08±7.27)％明顯高于非侵襲性肝癌(37.86±6.36)％(P＜0.05)。侵襲性肝癌的p53基因突變率(72.72％)明顯高于非侵襲性肝癌(25.64％)(P＜0.05)。而在不同大小肝癌中，MDM2基因表達值及p53突變率差異無顯著意義。無p53基因突變肝癌中的MDM2基因表達值(62.15±8.41)％明顯高于有突變者(38.57±4.82)％(P＜0.05)，MDM2低表達組肝癌的p53

3、突變率(56.14％)明顯高于MDM2高表達組(13.33％)(P＜0.05)。 結論:MDM2基因過表達、p53基因突變與肝細胞癌的侵襲性有關。MDM2基因過表達可能是p53基因失活的重要機制。 第二部分:原發(fā)性肝癌中MDM2、p53蛋白的表達及其臨床病理意義 目的:探討p53、MDM2蛋白表達在原發(fā)性肝癌中的相互關系和病理意義。 方法:應用免疫組化方法，總結本院72例原發(fā)性肝細胞癌和65例相應癌旁肝組

4、織中p53、MDM2的蛋白表達情況，并聯(lián)系臨床病理結果進行統(tǒng)計學分析。 結果:原發(fā)性肝細胞癌中p53、MDM2蛋白表達陽性率癌組織均明顯高于癌旁肝組織(分別為52.78％vs7.69％，P＜0.0001；26.39％vs6.15％，P＜0.01)，p53、MDM2兩者間蛋白表達陽性率差異無顯著意義(P＞0.05)，MDM2蛋白表達陽性率與腫瘤包膜是否完整及有無血管瘤栓顯著相關(分別為P＜0.0001，P=0.0001)，而與腫瘤

5、大小、有無并發(fā)肝炎肝硬化及病理分級無關(P＞0.05)。 結論:MDM2、p53蛋白高表達在HCC的發(fā)生中起重要作用，MDM2蛋白表達與肝癌侵襲性密切相關。 第三部分:SUMO-1在p53-MDM2反饋調節(jié)環(huán)中的作用機理 目的:研究小分子泛素樣修飾蛋白-1(smallubiquitin-likemodifier-1，SUMO-1)在p53-MDM2反饋調節(jié)環(huán)中的作用機理。 方法:用含人野生型p53基因質粒

6、pcDNA3-wtp53(pwtp53)、含人雙微粒體基因2(murinedoubleminutegene2，MDM2，鼠雙微粒體基因2，人同源基因為HDM2)質粒pCMV-HDM1B(pMDM2)、含人SUMO-1基因質粒pcDNA3-His6-SUMO-1(pSUMO-1)和空質粒pcDNA3轉染HepG2細胞，獲得各轉染細胞系，應用Westernblot檢測轉染后細胞中質粒蛋白的表達及流式細胞技術檢測細胞凋亡比例。 結果:

7、轉染pwtp53和pMDM2質粒的HepG2細胞均可見p53及MDM2蛋白條帶，同時轉染pSUMO-1質粒的細胞分別可見被SUMO-1修飾的相對分子量較大的p53和MDM2蛋白條帶，在未轉染任何質粒、僅轉染空質粒和pSUMO-1質粒的細胞中只檢測到少量p53蛋白表達。轉染pwtp53及pwtp53+pSUMO-1質粒的HepG2細胞凋亡比例分別為(16.79±1.62)％和(18.15±1.36)％，轉染pwtp53+pMDM2質粒的細

8、胞凋亡比例則下降至(5.17±1.23)％，而轉染pwtp53+pMDM2+pSUMO-1質粒的細胞凋亡比例則上升至(14.06±1.84)％，與轉染pwtp53+pMDM2質粒的細胞相比差異有顯著性意義(P＜0.01)，其他細胞中的凋亡比例均≤2％，差異無顯著性意義(P＞0.05)。 結論:SUMO-1通過與p53蛋白的結合或翻譯后修飾，抑制MDM2等癌基因蛋白對p53蛋白的降解，可增強p53抑癌基因誘導的細胞凋亡。

9、第四部分:p53、MDM2和SUMO-1在抗腫瘤藥物誘導細胞凋亡中的作用機理 目的:探討p53、MDM2和SUMO-1在化療藥5-Fu誘導的HepG2細胞凋亡中的影響及其作用機理。 方法:5-Fu誘導HepG2細胞產生凋亡，以質粒pCMV-HDM1B(pMDM2)和pcDNA3-His6-SUMO-1(pSUMO-1)轉染細胞，應用Westernblot檢測經(jīng)藥物誘導及轉染前后細胞中內源性p53蛋白的表達強度，流式細胞儀

10、檢測細胞凋亡比例變化，免疫熒光顯微鏡觀察p53蛋白在細胞漿及細胞核中的表達。 結果:隨藥物誘導濃度的增加，HepG2細胞內源性p53蛋白表達強度和細胞凋亡率與對照組相比明顯增高(P＜0.01)，于1×10-3mol/L濃度處最強，呈濃度依賴性，細胞漿、細胞核內均可見p53蛋白，且以細胞漿表達為主。轉染pMDM2的細胞具有明顯的抗凋亡特性，與同濃度未轉染細胞相比，p53蛋白表達強度和細胞凋亡率均明顯下降(P＜0.01)，p53蛋白

11、表達在細胞漿、細胞核內均減少。共轉染pSUMO-1的細胞其濃度-蛋白表達強度-凋亡率曲線又接近未轉染細胞，與單純轉染pMDM2細胞相比差異有顯著性(P＜0.01)，細胞漿、細胞核內p53蛋白表達重新出現(xiàn)，且以核內更明顯。只轉染pSUMO-1的細胞p53蛋白在細胞漿、細胞核內的表達和凋亡率與未轉染細胞相似，兩者間差異無顯著性。 結論:SUMO-1通過抑制MDM2對p53在胞漿的降解及增強p53在細胞核內的表達,可促進化療藥物誘導的