TM4SF1在胰腺癌中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、本研究旨在研究TM4SF1基因在胰腺癌中的作用。利用免疫組化及qRT-PCR證實(shí)TM4SF1在胰腺癌組織中高表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果顯示TM4SF1幾乎在所有胰腺癌細(xì)胞株中高表達(dá)。應(yīng)用siRNA及shRNA技術(shù)沉默胰腺癌細(xì)胞株MPanc96、MIAPaCa-2、PANC-1及HPAC中TM4SF1基因，沉默此基因后胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力與對(duì)照siRNA及shRNA相比明顯減弱。但胰腺癌細(xì)胞的增殖能力沒有明顯改變。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，

2、應(yīng)用siRNA及shRNA沉默TM4SF1基因后，胰腺癌細(xì)胞株MPanc96、MIA PaCa-2、PANC-1及HPAC在吉西他濱處理后凋亡細(xì)胞百分比明顯增加。在體內(nèi)試驗(yàn)中，應(yīng)用慢病毒在MIA PaCa-2細(xì)胞中沉默TM4SF1基因，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株并原位注射于裸鼠的胰腺，結(jié)果顯示shTM4SF1組的肝肺轉(zhuǎn)移明顯少于shControl組，并且對(duì)吉西他濱的敏感性明顯增加。沉默HUVEC TM4SF1后，細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)形成明顯減少。綜上所述

3、，TM4SF1在胰腺癌中高表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲，沉默TM4SF1基因可增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，并可抑制HUVEC細(xì)胞體外毛細(xì)血管腔的形成。因此，TM4SF1有望成為未來胰腺癌基因治療的新靶點(diǎn)。
　　 胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤，近年來其患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。近期流行病學(xué)調(diào)查資料表明，中國胰腺癌報(bào)告死亡率、校正死亡率、年齡標(biāo)化死亡率平均年增長速度分別為5.53％,6.41％和4.57％.胰腺癌在中

4、國腫瘤死亡中的構(gòu)成比從1991年的1.83％增加到2000年的2.26％，已成為我國常見的惡性腫瘤。目前外科手術(shù)切除是治愈胰腺癌的唯一方法，腫瘤完整切除的病例術(shù)后5年生存率在20％-30％。因此迫切需要深入探討胰腺癌發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制，以尋找診斷與治療胰腺癌的新途徑。
　　 TM4SF1是四次跨膜蛋白家族的成員，此家族還包括TM4SF5、TM4SF18及il-TMP三個(gè)成員。TM4SF1首次發(fā)現(xiàn)于肺癌的免疫治療的一種抗原，既而

5、在許多上皮來源的腫瘤中發(fā)現(xiàn)，如結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TM4SF1參與癌細(xì)胞的遷移與侵襲功能。
　　 本研究將檢測(cè)胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞株中TM4SF1的表達(dá)情況。通過RNAi基因沉默技術(shù)沉默TM4SF1基因，觀察體內(nèi)體外是否對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及對(duì)吉西他濱的敏感度有影響。
　　 一、TM4SF1基因在胰腺癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)
　　 目的：檢測(cè)胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞

6、株中TM4SF1基因表達(dá)水平。
　　 材料和方法：收集手術(shù)切除的胰腺癌組織6例、癌旁組織5例及慢性胰腺炎組織5例，試用免疫組化方法檢測(cè)TM4SF1的表達(dá)位置，并用qRT-PCR法檢測(cè)TM4SF1基因在mRNA水平上的表達(dá)情況。應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)18株胰腺癌細(xì)胞株與正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞(HPDE)中的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：本研究中免疫組化顯示TM4SF1基因在癌旁胰腺組織中有少量表達(dá)，在胰腺癌中尤其在管腔內(nèi)壁大量表達(dá)

7、；qRT-PCR結(jié)果顯示TM4SF1在胰腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(Mann-Whitney U test P=0.0087)及慢性胰腺炎組織(Mann-Whitney U testP=0.0043)。并且與人正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞HPDE相比TM4SF1在幾乎所有的被檢測(cè)的18株胰腺癌細(xì)胞株中均高表達(dá)。
　　 結(jié)論：TM4SF1基因在胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞株中高表達(dá)，初步證實(shí)TM4SF1的高表達(dá)與胰腺癌相關(guān)。
　　

8、 二、沉默TM4SF1對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及對(duì)吉西他濱敏感性的影響
　　 目的：檢測(cè)siTM4SF1及shTM4SF1對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及對(duì)吉西他濱敏感性的影響。
　　 材料與方法：應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默胰腺癌細(xì)胞株MPanc96、MIAPaCa-2及PANC-1中TM4SF1。并應(yīng)用Transwell(R)Polycarbonate Membrane Inserts與BioCoat Matrige

9、linvasion chamber檢測(cè)siControl與siTM4SF1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株的遷移及侵襲能力。應(yīng)用MST檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。應(yīng)用不同濃度的吉西他濱處理細(xì)胞，其凋亡情況應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)沉默胰腺癌細(xì)胞株MPanc96、MIAPaCa-2及HPAC中TM4SF1，應(yīng)用puromycin進(jìn)行篩選，從而建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。同時(shí)也進(jìn)行細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及吉西他濱處理后凋亡細(xì)胞百分比檢測(cè)。
　　

10、結(jié)果：本研究應(yīng)用siTM4SF1成功沉默胰腺癌細(xì)胞株MPanc96、MIA PaCa-2及PANC-1中TM4SF1，遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)中siTM4SF1明顯降低透膜的胰腺癌細(xì)胞數(shù)(P＜0.05)，但MTS顯示細(xì)胞的增殖無明顯差異。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，siTMSF1沉默此基因后使吉西他濱處理后胰腺癌細(xì)胞的凋亡比例增加(P＜0.05)。shTM4SF1成功沉默胰腺癌細(xì)胞株MPanc96、MIA PaCa-2及HPAC中TM4SF1，shTM4

11、SF1也明顯降低遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)中透膜的胰腺癌細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)，但MTS顯示細(xì)胞的增殖仍無明顯差異。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，shTMSF1沉默此基因后使吉西他濱處理后胰腺癌細(xì)胞的凋亡比例增加(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：證實(shí)siTM4SF1與shTM4SF1均可降低胰腺癌細(xì)胞株的遷移、侵襲能力，但對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖無明顯作用，可增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。
　　 三、shTM4SF1裸鼠原位移植瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究<

12、br>　　 目的：檢測(cè)shTM4SF1在裸鼠原位移植瘤內(nèi)對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及對(duì)吉西他濱敏感性的影響。
　　 材料與方法：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的shTM4SF1轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)luciferase的胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，每只裸鼠胰腺原位注射250,000個(gè)細(xì)胞。一周后開始注射吉西他濱(100mg/kg)，分為四組分別為：A組shControl；B組shControl+GEM；C組shTM4SF1；D

13、組shTM4SF1+GEM。7周后處死裸鼠，切除腫瘤、肺臟及肝臟，稱量腫瘤的重量，應(yīng)用bioluminescence方法對(duì)肝肺進(jìn)行成像并對(duì)其定量。應(yīng)用TUNEL及PCNA染色檢測(cè)癌組織的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果：與預(yù)期的一樣，shControl組與shTMSF1組的腫瘤重量無顯著差異(0.934±0.132g vs.00.750±0.149g，P=0.372)，但經(jīng)過吉西他濱處理后，shTM4SF1組的腫瘤重量明顯輕

14、于shControl組(0.792±0.101g vs.0.398±0.080g，P=0.0129)。并且shTM4SF1組肝肺轉(zhuǎn)移明顯少于shControl組(P=0.007、P=0.0265)。PCNA染色結(jié)果顯示，shTM4SF1+GEM組的陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于shControl+GEM組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：在原位移植瘤中，沉默TM4SF1可以增加MIA PaCa-2細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，并抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

15、r>　　 四、TM4SF1在腫瘤血管形成中的作用
　　 目的：體外檢測(cè)TM4SF1在腫瘤血管形成中的作用。
　　 材料與方法：本試驗(yàn)應(yīng)用siControl與siTM4SF1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，并應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。將轉(zhuǎn)染后72h的HUVEC細(xì)胞鋪于聚合ECMatrix上，6h后在顯微鏡下評(píng)估管狀形成情況。
　　 結(jié)果：HUVEC表達(dá)TM4SF1，經(jīng)過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siTM4SF1后表達(dá)

16、量明顯降低。并且沉默TM4SF1后，HUVEC細(xì)胞的形成的管狀結(jié)構(gòu)明顯減少。
　　 結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TM4SF1與腫瘤血管形成相關(guān)。
　　 通過上述研究，本課題得出以下結(jié)論：
　　 1.TM4SF1在胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞株中均高表達(dá)。
　　 2.siTM4SF1與shTM4SF1可降低體外胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，并增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。
　　 3.沉默TM4SF1可以增加M