rAd-Smurf1對BMP-7誘導人牙髓細胞分化的影響.pdf

1、BMPs可促進成牙本質(zhì)細胞分化和第三期牙本質(zhì)的形成，在牙髓的損傷修復中發(fā)揮重要調(diào)控作用。BMPs生物學效應的分子機制涉及兩條重要的信號通路：Smads蛋白依賴性和Smads蛋白非依賴性信號轉(zhuǎn)導途徑。Smads蛋白依賴性信號轉(zhuǎn)導途徑由靶細胞膜上BMP受體及細胞質(zhì)內(nèi)各型Smads蛋白協(xié)同參與完成，是TGF-β超家族包括BMPs信號轉(zhuǎn)導的經(jīng)典通路。BMPs與細胞膜上相應受體結(jié)合后使BMP-Smad通路上游信號分子R-Smad磷酸化，磷酸化的R

2、-Smad與Smad4結(jié)合，形成Smad復合體后轉(zhuǎn)入核內(nèi)，在核內(nèi)蓄積引起靶基因的轉(zhuǎn)錄并引發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導。本課題組前期研究證實，重組腺病毒介導的BMP-7基因轉(zhuǎn)染人牙髓細胞可誘導堿性磷酸酶活性的增強，能促進人牙髓細胞的成牙本質(zhì)細胞向分化。但大量Smad復合物的積聚可引起基因轉(zhuǎn)錄的過度活化導致細胞表達產(chǎn)物的改變，因此Smads蛋白的降解對BMP-Smad通路的調(diào)控至關(guān)重要。泛素-蛋白水解酶復合體通路可通過調(diào)節(jié)Smad蛋白降解有效調(diào)控TGF-

3、β家族信號轉(zhuǎn)導，而E3泛素連接酶Smurf1作為該通路的核心因子，在參與調(diào)控BMP-Smad信號通路中發(fā)揮重要作用。但Smurf1參與Smad信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控機制對BMP-7誘導人牙髓細胞分化的影響，目前尚不清楚。因此，本實驗將帶有綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染人牙髓細胞，確定重組腺病毒轉(zhuǎn)染人牙髓細胞的最適MOI值；通過構(gòu)建攜帶有目的基因Smurf1的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染人牙髓細胞，檢測rAd-Smurf1轉(zhuǎn)染人牙髓細胞后堿性磷酸酶活性以

4、及牙本質(zhì)涎磷蛋白mRNA表達，闡明rAd-Smurf1轉(zhuǎn)染對BMP-7誘導人牙髓細胞分化的影響；通過對分子機制的研究，進一步探討Smurf1基因轉(zhuǎn)染人牙髓細胞對BMP信號蛋白Smad1，Smad5的調(diào)節(jié)作用，從分子水平探討Smurf1對BMP-7誘導人牙髓細胞分化的調(diào)控機制，為深入研究BMP-Smad信號轉(zhuǎn)導機制，增強BMP-7對人牙髓細胞的促分化作用提供實驗依據(jù)和理論基礎。
　　 目的：
　　 通過rAd-Smurf1

5、轉(zhuǎn)染人牙髓細胞構(gòu)建Smurf1穩(wěn)定表達的體外細胞模型，檢測BMP-7誘導前后胞內(nèi)ALP活性以及DSPPmRNA的表達，觀察Smurf1對BMP-7誘導人牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化的影響；檢測Smad1，Smad5蛋白的表達，從分子水平進一步觀察Smurf1基因轉(zhuǎn)染人牙髓細胞對BMP信號蛋白Smad1，Smad5的調(diào)節(jié)作用，探討Smurf1對BMP-7誘導人牙髓細胞分化的調(diào)控機制，為深入研究BMP-7促人牙髓細胞分化的調(diào)控機制，增強BMP

6、-7對人牙髓細胞的促分化作用提供實驗依據(jù)和理論基礎。
　　 研究方法：
　　 ①采用Ⅰ型膠原酶消化組織塊法培養(yǎng)hDPCs并鑒定組織來源。
　　 ②將rAd-EGFP、按感染復數(shù)(multipleofinfection，MOI)75、100、200轉(zhuǎn)染hDPCs48h后免疫熒光顯微鏡觀察各組綠色熒光蛋白表達情況，確定Ad轉(zhuǎn)染hDPCs的最適MOI值；流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后7drAd-EGFP對hDPCs的轉(zhuǎn)染效率；M

7、TT法檢測rAd-EGFP按最適MOI值轉(zhuǎn)染hDPCs4d、6d、8d、10d、12d后增殖活性。
　　 ③構(gòu)建rAd-Smurf1載體；Westernblot檢測rAd-Smurf1轉(zhuǎn)染48h后hDPCs中Smurf1蛋白的表達。
　　 ④rAd-Smurf1轉(zhuǎn)染hDPCs后檢測rhBMP-7誘導前后對ALP活性及SPPmRNA的表達量，觀察rAd-Smurf1轉(zhuǎn)染后hDPCs分化的生物學特性。
　　 ⑤rAd

8、-Smurf1轉(zhuǎn)染hDPCs后Westernblot檢測rhBMP-7誘導前后胞內(nèi)Smad1，Smad5蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 ①本研究采用Ⅰ型膠原酶消化組織塊法可有效進行hDPCs的原代培養(yǎng)。MTT結(jié)果顯示細胞具有較強的增殖活性；細胞來源鑒定結(jié)果顯示，所獲得的細胞均為抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性。
　　 ②rAd-EGFP轉(zhuǎn)染hDPCs后24h可見熒光表達，EGFP的表達數(shù)隨著MOI值的增加

9、而增高；48h熒光顯微鏡下觀察，當MOI值為75，100，200時轉(zhuǎn)染率分別為(84.79±1.14)％，(90.46±0.91)％，(95.8±1.48)％；按MOI值為100轉(zhuǎn)染hDPCs7d后流式細胞儀檢測rAd-EGFP轉(zhuǎn)染率為90.3％；MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組在各時間點吸光度值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 ③成功構(gòu)建rAd-Smurf1；Westernblot結(jié)果顯示rAd-Smurf1轉(zhuǎn)染h

10、DPCs后能成功表達Smurf1。
　　 ④rAd-Smurf1轉(zhuǎn)染hDPCs在200ng/mlrhBMP-7作用10d后與對照組比較，ALP活性檢測結(jié)果顯示ALP活性降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；Real-timePCR結(jié)果顯示DSPPmRNA的表達量下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，結(jié)果表明rAd-Smurf1在rhBMP-7誘導hDPCs分化過程中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。
　　 ⑤rAd-Smurf1

11、轉(zhuǎn)染hDPCs在200ng/mlrhBMP-7作用48h后，Westernblot免疫印記結(jié)果顯示Smad1，Smad5蛋白表達較對照組有明顯減少。
　　 結(jié)論：
　　 rAd-Smurf1轉(zhuǎn)染hDPCs可獲高效穩(wěn)定表達；rAd-Smurf1轉(zhuǎn)染hDPCs降低堿性磷酸酶表達活性及減少DSPPmRNA的表達量，對hDPCs的分化指標具有調(diào)控作用；從分子水平進一步探討Smurf1參與調(diào)控hDPCs內(nèi)BMP/Smad信號的分子