OsSPX1和OsSPX2負反饋調(diào)控OsPHR2功能的體外研究.pdf

1、擬南芥PHR1和水稻PHR2作為植物響應缺磷脅迫的中心調(diào)控因子，參與大部分下游缺磷響應基因的表達。含SPX結(jié)構(gòu)域的基因參與調(diào)控磷信號與體內(nèi)磷平衡也有報道。已有遺傳學證據(jù)表明水稻PHR2與水稻SPX1和SPX2（以下簡稱SPX1&2）之間存在著磷信號與磷平衡的負反饋調(diào)控途徑。
　　本實驗室前期實驗表明SPX1&2能通過結(jié)合PHR2的C端從而阻礙其與磷響應基因順式作用元件P1BS序列的結(jié)合，起到負調(diào)控PHR2轉(zhuǎn)錄功能的作用。而SPX1

2、&2如何負調(diào)控PHR2的功能機制還尚不清楚。本研究進一步通過體外實驗探究SPX1&2兩個核蛋白對PHR2的負控機制。
　　本研究首先構(gòu)建了SPX1和SPX2融合GST標簽的原核表達載體(pGEX-4T-1-SPX1和pGEX-4T-1-SPX2)，實驗發(fā)現(xiàn)在誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度1mmol/L，誘導溫度20℃，誘導時間16h時是原核蛋白表達的最適條件。體外Pull-down實驗表明加磷酸鹽(+Pi)條件下，P1B

3、S探針濃度的增加不會影響SPX1&2與PHR2的結(jié)合，而在無磷酸鹽(-Pi)條件下，隨著P1BS濃度的增加，SPX1&2結(jié)合PHR2的能力變?nèi)?。凝膠遷移(EMSA)實驗表明+Pi條件下，隨著SPX1&2蛋白濃度的增加，競爭結(jié)合PHR2的能力也增強，檢測到P1BS自由探針的量增多，而在-Pi條件下，并無此效應。磷濃度梯度實驗表明SPX1&2競爭結(jié)合PHR2的能力會隨著體外磷酸鹽(+Pi)濃度的增加而增強。同時，我們也分析了加氮(+N)、加