水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白OsPht1;2和OsPht1;6表達調(diào)控和功能的研究.pdf

1、磷是最為重要的生命元素之一，幾乎參與所有生命的重要代謝活動。由于化學和微生物的強烈固定，大多數(shù)自然土壤中的有效磷很低，限制著植物的生長發(fā)育。植物可以通過改變根系形態(tài)結(jié)構(gòu)和增強分泌物質(zhì)提高土壤生物有效態(tài)磷，但最終需要通過植物根系高效的吸收和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)-“磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白”來完成吸收和轉(zhuǎn)運。一般認為，Pht1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白可能是植物從根系磷的吸收到體內(nèi)磷轉(zhuǎn)運的主要完成者。水稻是最重要的糧食作物之一，也是最為重要的模式作物。因此研究水稻在磷脅迫環(huán)

2、境下的逆境反應分子機制，并對其進行遺傳改良具有重大的現(xiàn)實意義.在水稻基因組有13個基因編碼的蛋白屬于Pht1高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白家族，其中OsPht1;11（OsPT11）和OsPht1;13（OsPT13）受菌根特異性誘導表達，然而其他基因在吸收和轉(zhuǎn)運磷素中的功能尚不清楚。通過RT-PCR方法，我們發(fā)現(xiàn)在該家族基因中OsPht1;2和OsPht1;6在缺磷條件下轉(zhuǎn)錄水平表達量最大。鑒于在過去發(fā)表的文章中已經(jīng)將該家族的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白簡單定義

3、為OsPT，為了便于比較和簡單化，本文中所研究的兩個基因分別采用OsPT2和OsPT6命名。本研究以模式品種日本晴(Nipponbare)為材料，通過RT-PCR、轉(zhuǎn)基因和蛙卵等異源表達體系、電生理等方法研究了OsPT2和OsPT6的功能和表達調(diào)控，所獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.通過對OsPT2和OsPT6兩基因的氨基酸序列比對以及其磷酸化位點、糖基化位點、跨膜性等方面分析得出OsPT2和OsPT6具有Pht1家族基因的典型

4、特征，它們的同源性達到70％。通過序列比對分析，表明OsPT2和OsPT6在水稻基因組中都是以單拷貝形式存在，兩者都沒有內(nèi)含子。OsPT2基因位于第3條染色體，而OsPT6基因位于第8條染色體。系統(tǒng)進化樹分析表明，OsPT2和OsPT6基因在Pht1家族基因里面不屬于同一個小亞類，說明它們在功能上可能存在差異。對OsPT2和OsPT6基因啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，兩個基因的啟動子里面都含有兩個W-box，一個P1BS，而在OsPT6基因啟動子

5、序列中發(fā)現(xiàn)了兩個PHO-like element基序，據(jù)前人研究這三個可能是參與磷饑餓信號的調(diào)控因子在下游基因啟動子中的結(jié)合位點（元件）。
　　 2.OsPT2和OsPT6分別與GFP融合，形成的融合蛋白在洋蔥表皮細胞表達分析表明OsPT2和OsPT6都定位于細胞質(zhì)膜上，說明它們確實是質(zhì)膜蛋白基因，符合Pht1家族的基本特性。通過RT-PCR分析，表明OsPT2和OsPT6在缺磷條件下在根部均強烈增強表達；在葉片中缺磷同樣導致O

6、sPT6表達的明顯增強，但OsPT2的表達量增強相對較弱。
　　 3.為了研究OsPT2和OsPT6基因的時空表達和對磷饑餓的響應，我們擴增了OsPT2和OsPT6基因ATG上游5’端序列，長度分別為1670bp和2380bp用作表達分析，GUS基因作為報告基因，用來檢測兩個基因的時空表達。把重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入日本晴水稻中，并且整合到染色體上，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因得到Ti代轉(zhuǎn)基因苗，在高磷和低磷處理時來分析OsPT2和OsPT6基因的時空表達

7、譜。我們發(fā)現(xiàn)在缺磷三周后，OsPT2基因表達部位主要集中在根尖、側(cè)根發(fā)生區(qū)和根莖結(jié)合部的中柱部分。從組織切片結(jié)果可以看到，GUS報告基因主要在根尖的導管薄壁細胞中有表達，而表皮和皮層均未發(fā)現(xiàn)GUS基因表達；在側(cè)根發(fā)生區(qū)，同樣只有在中柱部位有明顯表達；在根冠部位沒有發(fā)現(xiàn)有GUS表達。說明OsPT2在缺磷或者低磷環(huán)境中主要負責把根中的磷酸鹽轉(zhuǎn)運到地上部去。
　　 同樣缺磷處理三周后，OsPT6基因在幼嫩的主根，側(cè)根和根莖結(jié)合部位有明

8、顯的GUS基因表達，而在供應了0.3 mM Pi處理植株中，沒有發(fā)現(xiàn)這些部位有報告基因的表達。OsPT6基因在幼根和側(cè)根的表皮、皮層和中柱細胞均有很強的表達。但是側(cè)根發(fā)生區(qū)，在主根的表達減弱，而在側(cè)根生長點表達很強。同時也發(fā)現(xiàn)，在根冠部位沒有GUS表達。說明OsPT6在缺磷或者低磷環(huán)境中同時負責吸收和運輸磷酸鹽。
　　 我們還發(fā)現(xiàn)，在缺磷條件下在葉片中均檢測出OsPT2和OsPT6兩個基因各自的內(nèi)源啟動子所驅(qū)動的GUS表達，而在

9、正常供磷條件下其表達明顯減弱。OsPT2和OsPT6兩個基因在一些成熟器官中也有表達。OsPT2在灌漿期種子和發(fā)芽種子中表達，OsPT6在花藥和發(fā)芽種子中都能檢測到。
　　 4.蛙卵細胞中表達OsPT2和OsPT6可使細胞中磷的吸收量分別提高5倍和7倍，微電極測定細胞膜電位變化分析發(fā)現(xiàn)供應1 mM Pi可使表達OsPT2的蛙卵細胞去極化，這種去極化程度隨著供應的磷濃度提高到10 mM而大幅提高。表明OsPT2是低親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)

10、運蛋白，而且是2個摩爾以上質(zhì)子與1個摩爾H2PO4-的共轉(zhuǎn)運或3個摩爾以上的質(zhì)子與1個摩爾HPO42-的共轉(zhuǎn)運蛋白。然而表達OsPT6的蛙卵細胞檢測不到介質(zhì)磷酸鹽的供應對細胞膜電位的變化，表明有別于OsPT2， OsPT6可能是一個高親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，也可能是與質(zhì)子共轉(zhuǎn)運但凈電荷呈中性的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白。
　　 5.通過泛素啟動子驅(qū)動OsPT6在水稻（日本晴）中的超表達，獲得了在正常供磷條件下與野生型相比OsPT6顯著增強的

11、多個株系.在正常供磷條件下OsPT6的過量表達能大幅提高水稻地上部分磷的積累，植株表現(xiàn)出矮小，老葉枯斑和枯死等磷毒害癥狀.這種類似磷毒害癥狀能隨著外源供應磷的濃度下降而得到緩解，說明OsPT6參與調(diào)控了水稻體內(nèi)磷素的平衡。
　　 6.通過構(gòu)建含有可能與磷信號轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的不同基序以及拷貝數(shù)的啟動子與GUS報告基因融合基因轉(zhuǎn)化水稻，發(fā)現(xiàn)在水稻體內(nèi)P1BS和W-box兩種基序為磷饑餓反應的結(jié)合元件，它們是水稻OsPT6基因磷饑餓下高

12、度特異表達調(diào)控的關鍵元件，同時發(fā)現(xiàn)W-box的拷貝數(shù)與該基因在缺磷或者低磷條件下的表達豐度相關，拷貝數(shù)越大表達量越強。
　　 綜合上述結(jié)果，我們認為水稻體內(nèi)存在非常復雜的磷信號途徑。盡管OsPT2和OsPT6均是缺磷增強表達的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，但它們可能接受上游的磷信號途徑不完全相同，兩者的表達部位、對磷酸鹽的親和力和對介質(zhì)酸度的要求等功能方面表現(xiàn)很大的差異。利用不同磷素供應條件和不同部位表達的特異和人工啟動子有可能能改變它們的表