水稻OsSPX4蛋白調控磷中心調控因子OsPHR2的機制研究.pdf

1、擬南芥（Arabidopsis thaliana）中系統(tǒng)磷信號與磷平衡受中心調控因子AtPHR1及其部分功能互補的家族成員AtPHL1調控，它是一類具MYB-CC結構域的轉錄因子。AtPHR1在植物中具有功能的保守性，它在水稻中的同源基因OsPHR2是水稻調控缺磷脅迫響應的中心轉錄調控因子。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)，水稻體內有6個僅包含SPX結構域的蛋白，除了OsSPX4之外，其余5個基因均受缺磷誘導表達，推測OsSPX4蛋白同其它Os

2、SPX蛋白相比具有不同的功能機制。水稻spx4突變體中，植株地上部分磷積累，缺磷向應基因表達顯著上調。反之，在OsSPX4的過表達植株OxSPX4中，缺磷響應基因表達受到抑制。
　　通過分析OsSPX4與OsPHR2雙過表達材料（記為OxSPX4/OxPHR2），發(fā)現(xiàn)在雙過表達材料中，OxSPX4回復了OxPHR2材料在正常磷條件下地上部磷積累和磷信號上調的表型，使磷濃度和磷信號回復到了野生型水平，表明OsSPX4具有負調控OsP

3、HR2功能的作用。
　　分析OsSPX4p-OsSPX4-G US和OsSPX4p-OsSPX4-GFP轉基因融合材料顯示，OsSPX4蛋白在缺磷條件下，蛋白量顯著下調。同時，在體內缺磷條件下OsSPX4蛋白的半衰期顯著變短，表明缺磷條件加速OsSPX4蛋白的降解。利用體外降解體系，對GST-SPX4蛋白的體外穩(wěn)定性進行檢測，結果表明缺磷條件下GST-SPX4蛋白的降解加快，半衰期變短。但體外添加10 mM和25 mM磷酸鹽(Na

4、H2PO4，Pi)以及25mM亞磷酸鹽（NaHPO3，Phi）時，GST-SPX4蛋白的穩(wěn)定性有較大程度提高。與此同時，體外添加N(NaNO3)和S(Na2SO4)對GST-SPX4蛋白的穩(wěn)定性沒有影響，說明Pi提高OsSPX4蛋白的穩(wěn)定性具有特異性。
　　利用酵母雙雜交以及免疫共沉淀等技術研究表明OsSPX4與OsPHR2可在體內和體外進行互作，OsSPX4中包含有SPX結構域的N端，以及OsPHR2中包含有MYB和CC結構的C

5、端是兩個蛋白的互作結構域。通過染色質免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，Chip）以及凝膠阻滯電泳(ElectrophoreticMobility Shift Assay, EMSA)進行體內和體外分析發(fā)現(xiàn)，OsSPX4蛋白通過與OsPHR2的互作，影響OsPHR2與其下游結合基因啟動子的P1BS(PHR1 BindingSequence)元件的結合。
　　采用雙分子熒光互補技術(Bimolec

6、ular fluorescence complementation，BiFC)確定了OsSPX4與OsPHR2互作的主要亞細胞部位是在細胞質中，但細胞核中也有互作信號。將35S-OsPHR2-mCherry和35S-OsSPX4-GFP融合基因共轉入水稻原生質體中進行觀察，發(fā)現(xiàn)同對照（35S-OsPHR2-mCherry和35S-GFP共轉入水稻原生質體）相比，OsPHR2-mCherry的主要熒光信號在細胞質中，而對照組的OsPHR2

7、-mCherry信號主要在細胞核中。表明OsSPX4對OsPHR2進入核內具有阻礙作用。進一步分析轉基因材料OsPHR2p-OsPHR2-FLAG、OsPHR2p-OsPHR2-FLA G/spx4和OsPHR2p-OsPHR2-FLAG/OxSPX4，表明在spx4突變體的條件下，OsPHR2-FLAG蛋白在細胞質和細胞膜中的蛋白豐度都高于野生型，但在細胞核中具有極顯著的提高。在OxSPX4過表達的材料中，同野生型相比細胞質中蛋白的豐

8、度沒有顯著變化，但細胞核中的OsPHR2-FLAG蛋白的豐度顯著降低。結果進一步證明了細胞水平的結果，即OsSPX4影響OsPHR2在細胞核中的亞細胞定位。
　　綜上所述，OsSPX4與OsPHR2在細胞質與核內互作，進而負調控OsPHR2功能。OsSPX4在蛋白水平響應缺磷信號。在細胞缺磷狀況下OsSPX4蛋白通過蛋白降解途徑降解，從而增強OsPHR2進核并與其順勢作用元件P1BS結合，啟動其下游基因響應缺磷信號及提高磷的吸收能