TIPE2蛋白調控細胞增殖和炎癥的機制研究.pdf

1、本項目一方面以血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖介導的血管重構為切入點，系統(tǒng)研究TIPE2在血管術后再狹窄(Restenosis)中的作用及其機制，另一方面以炎癥角度探討TIPE2通過調控巨噬細胞精氨酸代謝抑制炎癥的分子機制。
　　研究目的：
　　1.探討TIPE2蛋白在Restenosis發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制;
　　2.研究TIPE2調節(jié)精氨酸代謝抑制炎癥

2、的分子機制。
　　研究方法：
　　一、TIPE2蛋白調控Restenosis的機制研究
　　1.TIPE2對小鼠Restenosis發(fā)生發(fā)展的作用研究
　　1.1 Retenosis小鼠模型構建
　　1.2 TIPE2重組腺病毒感染實驗
　　1.3 HE染色及分析
　　1.4 EDU摻入實驗
　　1.5 TUNEL染色
　　2.TIPE2調控Restenosis形成的機制研究

3、　　2.1小鼠原代VSMCs培養(yǎng)
　　2.2 TIPE2調控VSMCs增殖、細胞周期分布的研究
　　2.3 TIPE2調控VSMCs增殖的機制研究
　　2.4 TIPE2調控STAT3、ERK1/2信號通路的機制探討
　　二、TIPE2蛋白調控巨噬細胞精氨酸代謝的研究
　　1.巨噬細胞除菌功能檢測
　　2.TIPE2穩(wěn)定表達細胞株構建
　　3.腹腔巨噬細胞分離培養(yǎng)
　　4.細胞處理

4、　　5.小鼠模型構建及分析
　　研究結果：
　　1.TIPE2蛋白抑制實驗性Retenosis的發(fā)展
　　1.1 TIPE2過表達顯著抑制損傷引起的血管術后再狹窄。血管損傷6周時，TIPE2過表達組的NIA及I/M值分別為19.36±2.905×103μm2、0.8888±0.1374，顯著低于對照組的37.78±2.402×103μm2、1.885±0.1794。這些結果說明TIPE2可以抑制小鼠Restenosis

5、的發(fā)生發(fā)展。
　　1.2 TIPE2缺失促進VSMCs增殖，但對細胞凋亡沒有明顯影響。損傷后第7天，TIPE2缺失組的血管中膜EDU陽性細胞率顯著高于WT組（TIPE2-/-vs.WT,21.69±2.639％ vs.9.58±1.625％,P=0.0175），而TUNEL陽性細胞率則與WT組沒有顯著性差異（TIPE2-/-vs.WT，5.77±1.925％ vs.6.03±1.310％，P=0.9136），提示TIPE2主要通過

6、調控VSMC增殖抑制Restenosis的發(fā)生發(fā)展。
　　1.3損傷及PDGF-BB刺激顯著上調VSMCs的TIPE2表達
　　PDGF-BB刺激原代培養(yǎng)的VSMCs可以顯著上調TIPE2 mRNA及蛋白表達。與此相似，損傷后第7天、14天，WT模型小鼠的血管中膜TIPE2表達水平均有不同程度的上調，但第14天的表達強度低于第7天，總體上呈現(xiàn)升高后逐漸恢復的趨勢。
　　1.4 TIPE2通過調控Cyclin D1、Cy

7、clin D3的表達抑制VSMCs增殖
　　體外利用PDGF-BB刺激WT、TIPE2-/-VSMCs，分析細胞周期分布。結果發(fā)現(xiàn)，TIPE2缺失加快細胞從G0/G1期向S期轉換，并伴隨著Cyclin D1、CyclinD3的上調。而TIPE2過表達則顯著下調D型周期蛋白表達及細胞周期轉換效率，從而抑制細胞增殖。TIPE2 R24A突變體（該突變體基本喪失與Rac1結合能力）對細胞周期蛋白及周期轉換均沒有明顯影響，提示TIPE2對

8、細胞增殖的調控可能依賴于Rac1信號通路。
　　1.5 TIPE2通過抑制Rac1-STAT3、Rac1-ERK信號通路調控VSMCs增殖
　　比較Rac1、STAT3及ERK信號分子在WT及TIPE2-/-VSMCs的活化水平差異，結果發(fā)現(xiàn)TIPE2缺失顯著增強Rac1、STAT3以及ERK的活化，而TIPE2過表達則結果相反。此外，Rac1抑制劑NSC23766抑制Rac1的活性后，TIPE2對STAT3及ERK1/2的

9、抑制作用消失，聯(lián)合應用STAT3、ERK1/2抑制劑處理VSMCs，TIPE2缺陷導致的Cyclin D1、Cyclin D3表達上調現(xiàn)象消失，說明TIPE2主要通過Rac1-STAT3、Rac1-ERK信號通路調控VSMCs增殖。
　　1.6 TIPE2調控STAT3活化后核轉位的機制
　　TIPE2可以抑制STAT3活化，TIPE2基因缺失顯著促進STAT3在細胞核內的募集。進一步利用活化突變體STAT3-C過表達的HE

10、K293細胞以及WT VSMCs研究TIPE2是否對活化后STAT3入核過程具有直接調控作用。結果發(fā)現(xiàn)TIPE2及Rac1抑制劑能夠顯著抑制STAT3-C的入核，且TIPE2的抑制作用能夠被Rac1-Q61L（Rac1活化突變體）消除，說明TIPE2以Rac1依賴方式調控STAT3的核轉位過程。
　　2.TIPE2通過調控巨噬細胞精氨酸代謝抑制炎癥反應
　　2.1 TIPE2基因缺失增強NO介導的抗菌作用
　　與WT相

11、比，TIPE2-/-腹腔巨噬細胞具有更強的抗菌功能（殺菌率:TIPE2-/-vs.WT，68.57±4.234％ vs.46.53±4.347％，P=0.0221），而iNOS抑制劑1400w處理能顯著縮小兩者的差距（TIPE2-/-vs.WT，51.93±3.726％ vs.36.87±5.095％，P=0.0378），說明TIPE2缺失促進NO介導的殺菌作用。
　　2.2 TIPE2過表達降低Raw264.7巨噬細胞的iNOS

12、水平，同時促進精氨酸酶Ⅰ的表達
　　巨噬細胞中NO的產生主要依賴于iNOS。為了研究TIPE2是否調控iNOS表達，我們構建了穩(wěn)定表達TIPE2的Raw264.7巨噬細胞系， LPS刺激后檢測iNOS表達變化。結果發(fā)現(xiàn)，TIPE2過表達抑制LPS誘導的iNOS表達，同時顯著上調精氨酸酶Ⅰ(ArginaseⅠ，ARG1)的mRNA水平，而對精氨酸酶Ⅱ(ArginaseⅡ，ARG2)則沒有明顯的影響。這些結果提示，TIPE2可能通過調

13、控iNOS與ARG1的表達水平，影響精氨酸代謝途徑的轉換。
　　2.3 TIPE2過表達抑制Raw264.7巨噬細胞NO、但促進尿素(Urea)的產生
　　Arginase與iNOS均以精氨酸(Arginine)為底物，在精氨酸代謝上互為競爭關系。為了證明TIPE2調節(jié)iNOS及ARG表達水平確實改變了巨噬細胞在精氨酸代謝上的傾向，我們對這兩個酶的產物進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)，TIPE2過表達細胞的尿素水平比對照組高，而NO水平則

14、顯著低于對照組，說明TIPE2過表達調控Raw264.7巨噬細胞的精氨酸代謝途徑選擇傾向，導致精氨酸代謝從iNOS途徑轉向arginase途徑。
　　2.4 TIPE2缺失促使巨噬細胞精氨酸代謝從iNOS向arginase途徑轉換
　　進一步利用TIPE2缺陷的巨噬細胞反向驗證TIPE2調控精氨酸代謝的功能，發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后TIPE2-/-巨噬細胞iNOS表達水平、NO水平顯著高于WT細胞;而ARG1 mRNA及尿素水平則

15、顯著低于對照組。該結果從功能缺失的角度進一步驗證TIPE2改變巨噬細胞精氨酸代謝傾向的功能。
　　2.5 TIPE2缺陷促進小鼠體內iNOS表達及NO產生
　　利用敗血癥模型小鼠體內驗證TIPE2調控精氨酸代謝的功能，發(fā)現(xiàn)LPS刺激后，TIPE2缺陷小鼠肝、肺組織的iNOS mRNA及蛋白水平顯著高于WT小鼠，其血清NO也比WT小鼠高;相應的，TIPE2-/-小鼠肝、肺組織里的ARG1的表達水平則比WT小鼠低。
　　2

16、.6 TIPE2缺陷促進小鼠巨噬細胞NF-κB、JNK及p38信號通路的活化
　　文獻報道，NF-κB、MAPK信號通路是LPS上調巨噬細胞iNOS表達重要機制。因此，我們檢測了WT、TIP2-/-小鼠腹腔巨噬細胞中LPS誘導的通路活化情況。結果發(fā)現(xiàn)，TIPE2缺失后IκB的磷酸化水平及降解程度均顯著提高，JNK及p38磷酸化水平也明顯提高，而ERK1/2活化僅有微弱的增強。該結果提示TIPE2可能主要通過NF-κB、JNK及p3

17、8信號通路抑制iNOS表達及其介導的炎癥反應。
　　研究結論：
　　1.TIPE2通過抑制VSMCs增殖抗實驗性Restenosis。TIPE2抑制Rac1導致下游ERK1/2以及STAT3活化、入核等過程受阻是TIPE2抑制VSMCs增殖、抵抗Restenosis的主要分子機制。
　　2.TIPE2抑制LPS引起的iNOS上調，使巨噬細胞中精氨酸優(yōu)先代謝為尿素，從而發(fā)揮抗炎作用。
　　創(chuàng)新點及意義：