Tudor-SN蛋白參與細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖調(diào)控的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：細(xì)胞周期，是一個(gè)細(xì)胞從上一次分裂發(fā)生，到下一次分裂形成兩個(gè)子細(xì)胞的過(guò)程，它是生命不斷延續(xù)并更新的基礎(chǔ)。細(xì)胞通過(guò)每個(gè)周期的完成，來(lái)實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的復(fù)制以及平均分配。細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化之間存在著密切的聯(lián)系，它們彼此協(xié)調(diào)，互相控制，共同在多種疾?。ㄓ绕涫悄[瘤）中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞周期的調(diào)控涉及細(xì)胞周期蛋白（cyclins）的時(shí)序性表達(dá)和降解、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（Cdks）和Cdk抑制蛋白（CdkIs）活性的改變、以及一些

2、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等。Tudor-SN蛋白是一個(gè)在多種動(dòng)、植物細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)的保守的多功能蛋白，近些年不斷有研究發(fā)現(xiàn)Tudor-SN蛋白參與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Tudor-SN蛋白可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞G1期至S期的周期進(jìn)程；并且當(dāng)細(xì)胞同步化于G1末期，再向S期釋放時(shí)， Tudor-SN蛋白的敲低可以阻止細(xì)胞向S期的釋放?？梢?jiàn)，Tudor-SN蛋白是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞周期調(diào)控的調(diào)節(jié)因子。但關(guān)于Tudor-SN

3、蛋白調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的詳細(xì)信號(hào)通路尚未揭示。課題組的相關(guān)研究還顯示，敲低Tudor-SN蛋白的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖活力，并且Tudor-SN蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)：在增殖能力旺盛的細(xì)胞中表達(dá)水平高，在終末分化退出增殖周期的細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)，但調(diào)控的原因并不清楚。本課題為解決以上兩個(gè)問(wèn)題，將分為兩部分展開(kāi)研究，第一部分旨在研究Tudor-SN蛋白調(diào)控細(xì)胞周期G1期至 S期進(jìn)程的具體機(jī)制；第二部分將探討不同增殖能力的細(xì)

4、胞或組織中Tudor-SN蛋白差異表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。希望通過(guò)兩部分的研究，完善Tudor-SN蛋白參與細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖調(diào)控的上游及下游信號(hào)通路，并為研究Tudor-SN蛋白通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期參與細(xì)胞的增殖、分化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供新的思路。
　　研究方法：本課題的研究主要分為兩個(gè)部分。第一部分研究旨在明確 Tudor-SN蛋白參與細(xì)胞周期G1期至S期周期進(jìn)程調(diào)控的具體機(jī)制：1）利用免疫共沉淀（CoIP）技術(shù)結(jié)合細(xì)胞同步化技術(shù)明確不

5、同周期時(shí)相Tudor-SN蛋白的表達(dá)水平及磷酸化修飾情況；2）利用 CoIP及激酶活性抑制等方法明確不同周期時(shí)相磷酸化 Tudor-SN蛋白的上游蛋白激酶；3）利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、點(diǎn)突變技術(shù)、流式細(xì)胞周期檢測(cè)、雙熒光素酶分析技術(shù)等明確Tudor-SN蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控的磷酸化修飾位點(diǎn)；4）利用雙熒光素酶活性分析技術(shù)、WB及PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Tudor-SN蛋白對(duì)S期基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用；5）利用CoIP、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）等方

6、法明確Tudor-SN蛋白調(diào)控S期基因表達(dá)的具體方式。第二部分探討不同增殖能力的細(xì)胞或組織中 Tudor-SN蛋白差異表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究：1）利用WB、Realtime PCR、蔗糖密度梯度離心、多聚核糖體分布分析等檢測(cè)Tudor-SN蛋白在終末分化心肌細(xì)胞中低表達(dá)的調(diào)控機(jī)制；2）通過(guò)DBTSS數(shù)據(jù)庫(kù)明確Tudor-SN mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并分析其是否具有5’TOP序列；3）利用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)合抑制劑的使用明確PI3K/ AKT

7、/ mTOR信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞系（HeLa）及心肌細(xì)胞系（H9C2）中對(duì)Tudor-SN蛋白及mRNA表達(dá)水平的調(diào)控；4）通過(guò) KEGG公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)前期心肌組織芯片的差異基因進(jìn)行Pathway分析，篩選出與PI3K/ AKT/ mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)系密切的基因，并利用Realtime PCR在出生1天及成年小鼠心肌組織中對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；5）利用流式細(xì)胞周期檢測(cè)分析Tudor-SN蛋白對(duì)PI3K/ AKT/ mTOR信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞

8、周期的影響。
　　結(jié)果：
　　1、Tudor-SN蛋白在不同細(xì)胞周期時(shí)相的絲/蘇氨酸磷酸化修飾水平不同， G1/S期及 G2/M期 Tudor-SN蛋白的絲/蘇氨酸磷酸化修飾水平高于其他期；而Cdk激酶是磷酸化Tudor-SN蛋白的上游激酶；Ser426/Thr429位點(diǎn)是Tudor-SN蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)；Tudor-SN蛋白通過(guò)募集組蛋白乙?；福℅CN5）至E2F-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，增強(qiáng)E2F-1與下游基

9、因（cyclinA, E2F-1）啟動(dòng)子的結(jié)合能力，促進(jìn)S期基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促成細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)換。
　　2、Tudor-SN在退出細(xì)胞周期的終末分化心肌細(xì)胞中僅蛋白低表達(dá)，mRNA表達(dá)并未降低，調(diào)控發(fā)生在翻譯水平；Tudor-SN mRNA含有5’TOP序列，并且其5’TOP序列對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控受PI3K/ AKT/ mTOR信號(hào)通路影響；Tudor-SN蛋白的表達(dá)受PI3K/ AKT/ mTOR/4EBP信號(hào)通路的調(diào)控；

10、成熟小鼠心肌組織中PI3K/ AKT/ mTOR信號(hào)通路處于低活性狀態(tài)；Tudor-SN蛋白影響PI3K/ AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。
　　結(jié)論：
　　1、Tudor-SN蛋白通過(guò)增強(qiáng) E2F-1下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞完成G1/S周期的轉(zhuǎn)換，在這個(gè)過(guò)程中，Cdk類(lèi)激酶是Tudor-SN蛋白的上游激酶，Ser426/Thr429是其參與周期調(diào)控的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)。
　　2、Tudor-SN是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)