哮喘小鼠氣道平滑肌原代細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的研究.pdf

1、第一部分 目的:制備哮喘小鼠模型。 方法:將3周齡雄性SPF級Balb/c小鼠16只，隨機(jī)分成哮喘組和對照組，每組8只。哮喘組于第0、7、14天每只腹腔內(nèi)注射抗原混懸液0.1ml(含雞卵清蛋白10mg和氫氧化鋁干粉10mg溶于生理鹽水中)致敏；第15天開始霧化吸入1％OVA激發(fā)哮喘，每周2至3次，每次30min，連續(xù)6周。對照組以等量生理鹽水進(jìn)行致敏和激發(fā)，每周2至3次，每次30min，連續(xù)6周。兩組小鼠均于末次霧化吸入

2、后24小時(shí)頸椎脫臼處死，無菌取氣管作細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，取左肺中葉作肺組織HE染色。 結(jié)果: 1．哮喘組小鼠在霧化致喘后出現(xiàn)較明顯的頭、面部搔癢，進(jìn)而呼吸加深、加快、點(diǎn)頭樣喘息明顯、安靜少動、弓背、前肢縮抬，掌面出現(xiàn)明顯皮疹。對照組小鼠無喘息等表現(xiàn)。 2．肺組織切片HE染色可見正常組小鼠氣道上皮完整，無炎細(xì)胞浸潤及平滑肌層增厚等改變；哮喘組小鼠有氣道上皮細(xì)胞破壞，支氣管周圍有大量嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤及平滑肌細(xì)胞層

3、增厚等改變結(jié)果。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功制備了小鼠哮喘模型，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 目的:建立原代培養(yǎng)小鼠的氣道平滑肌細(xì)胞的可行方法，為相關(guān)疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)材料。 方法:選取正常組和哮喘組同周齡的Balb/c小鼠，運(yùn)用組織貼塊法培養(yǎng)小鼠的氣道平滑肌細(xì)胞，并綜合了自然純化、機(jī)械刮除法、時(shí)差貼壁法等多種方法純化氣道平滑肌細(xì)胞。 結(jié)果:接種的組織塊活力良好，第三代氣道平滑肌細(xì)胞純度可以達(dá)到95％

4、以上。運(yùn)用間接免疫熒光法對平滑肌細(xì)胞α-肌動蛋白(α-actin)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，90％以上細(xì)胞染色結(jié)果為陽性，凍存后復(fù)蘇細(xì)胞活力良好。 結(jié)論:對于取材較少、操作相對困難的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞，以組織貼塊法原代培養(yǎng)較為可靠，方法簡便，獲得ASMC純度較高，為進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)研究提供了材料。 第三部分哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖及cyclin D1表達(dá)的差異 目的：研究哮喘小鼠氣道重建模型中氣道平滑肌細(xì)胞(AS

5、MC)的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達(dá)的變化，探討cyclin D1對支氣管哮喘氣道重建中平滑肌細(xì)胞增殖過程及細(xì)胞周期的影響，進(jìn)而為哮喘的臨床診斷和治療提供新的依據(jù)。 方法:以原代培養(yǎng)的正常小鼠ASMC為對照組研究哮喘組ASMC，用四唑鹽比色試驗(yàn)(MTT)檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定細(xì)胞周期，免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)cyclinD1在ASMC中的表達(dá)，F(xiàn)CM檢測cyc linD1表達(dá)量。

6、 結(jié)果: 1．MTT法分析哮喘小鼠ASMC的增殖差異：哮喘組小鼠的ASMC與正常組小鼠同代ASMC比較，前者細(xì)胞增殖顯著增快，MTT法測得各時(shí)間點(diǎn)的哮喘組細(xì)胞的平均A值均高于正常組細(xì)胞，差異有顯著性(P<0.05)。 2．FCM分析哮喘小鼠ASMC周期變化：哮喘組細(xì)胞周期與正常組有顯著差別，哮喘組增殖期(S期)百分比較正常組明顯增高。 3．免疫熒光細(xì)胞化學(xué)觀察Cyclin D1在ASMC表達(dá)情況：用激光共聚焦

7、顯微鏡觀察結(jié)果，正常、哮喘兩組ASMC均有Cyclin D1的表達(dá)，主要分布于胞質(zhì)內(nèi)。 4．FCM分析Cyclin D1在哮喘小鼠ASMC中的差異表達(dá)。3次分析取材于ASMC生長周期中的不同時(shí)間點(diǎn)，各次的2組間比較結(jié)果的趨勢一致：哮喘組細(xì)胞表達(dá)的Cyclin D1顯著高于A組的表達(dá)，差異有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論:在哮喘氣道重建過程中ASMC經(jīng)歷了一定程度的過增殖過程，cyclin D1的表達(dá)增加參與了細(xì)胞增殖。氣