Tudor-SN蛋白調(diào)控細胞內(nèi)應(yīng)激顆粒組裝的分子機制.pdf

1、目的：
　　應(yīng)激顆粒（Stress Granules，SGs）與加工體（Processing Bodies，PBs）是真核細胞受到氧化應(yīng)激、熱休克、紫外線照射及病毒感染等各種環(huán)境刺激時在胞漿中產(chǎn)生的與mRNA代謝密切相關(guān)的顆粒狀結(jié)構(gòu)。本課題組前期結(jié)果表明當HeLa細胞受到外界刺激，如0.5mM亞砷酸鈉氧化應(yīng)激或45℃熱休克時，Tudor-SN（Tudor Staphylococcal Nuclease）蛋白可以參與胞漿中SGs的組

2、裝，但深入的分子機制尚不完全清楚。本課題旨在進一步分析Tudor-SN蛋白的應(yīng)激動力學屬性及其在SGs組裝動力學中的作用機制。
　　方法：
　　本課題實驗分為三大部分，
　　第一部分：①利用細胞免疫熒光（Immunofluorescence，IF）、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染-共聚焦顯微鏡分析Tudor-SN蛋白顆粒與SGs/PBs的共定位關(guān)系；②利用熒光漂白后恢復（Fluorescence recovery after photobl

3、eaching，F(xiàn)RAP）技術(shù)分析HeLa細胞中Tudor-SN蛋白顆粒的胞內(nèi)應(yīng)激動力學屬性；③利用熒光漂白損失（Fluorescence loss in photobleaching，F(xiàn)LIP）技術(shù)分析Tudor-SN蛋白的核/漿穿梭屬性及與SGs組裝的相關(guān)性分析。
　　第二部分：①利用AKTA純化系統(tǒng)、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、GST融合蛋白釣?。℅ST-pulldown

4、）技術(shù)進行SGs中包含Tudor-SN的蛋白應(yīng)激復合物分析；②利用 Oligo(dT)親和層析、細胞熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation，RIP）等技術(shù)分析SGs中Tudor-SN蛋白與poly(A)+mRNA、AGTR1-3'UTR的結(jié)合及共定位關(guān)系。
　　第三部分：①

5、利用GFP-shRNA干擾和熒光漂白后恢復（FRAP）技術(shù)分析HeLa細胞中Tudor-SN對于SGs/PBs蛋白組裝動力學的影響；②以Tudor-SN基因敲除（Tudor-SN-/-）小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）為實驗對象，分析 Tudor-SN對于 poly(A)+ mRNA應(yīng)激顆粒形成的影響；③利用siRNA干擾和多聚核糖體解聚曲線分析研究Tudor-SN蛋白與多聚核糖體應(yīng)

6、激解聚的相關(guān)性；④以AGTR1-3'UTR（3'-untranslated region of angiotensin II receptor，type1 mRNA）為具體靶基因，利用GFP-MS2系統(tǒng)實現(xiàn)AGTR1-3'UTR的活細胞內(nèi)動態(tài)標記，并結(jié)合siRNA干擾、dsRed-shRNA干擾、熒光漂白后恢復（FRAP）、細胞免疫熒光、活細胞工作站等技術(shù)分析Tudor-SN蛋白對AGTR1-3'UTR應(yīng)激動力學行為的調(diào)控作用。

7、　　結(jié)果：
　　第一部分：①HeLa細胞內(nèi)源性Tudor-SN蛋白與SGs標記蛋白（HuR、PABP1、G3BP）存在顆粒共定位關(guān)系，與SGs/PBs共同蛋白（AGO1/2）部分共定位，但與PBs標記蛋白（DCP1a、GW182）并無共定位關(guān)系；外源性RFP-Tudor-SN融合蛋白與GFP-AGO2蛋白存在一定的顆粒共定位關(guān)系，但不與GFP-DCP1a/b、GFP-DCP2、GFP-GW182以及GFP蛋白共定位。②給予細胞高強

8、度激光漂白后，興趣區(qū)Tudor-SN蛋白顆粒的熒光強度降低到原來的~23％，隨后熒光信息恢復至漂白前熒光強度的~66.3%，光漂白后恢復速率 t1/2值為9.22±1.72sec。③給予細胞脈沖式重復光漂白后，興趣區(qū)Tudor-SN蛋白顆粒熒光信號完全消失，伴隨同一細胞內(nèi)鄰近檢測區(qū)Tudor-SN蛋白顆粒和細胞胞核內(nèi)Tudor-SN蛋白熒光信號的逐漸降低。
　　第二部分：①Tudor-SN蛋白可以與TIAR、AGO1/2、PABP

9、1、eIF5A、HuR、TTP等蛋白形成應(yīng)激復合物，但不包含 DCP1a蛋白，另外，Tudor-SN蛋白的SN1結(jié)構(gòu)域是介導其與PABP1、TIAR、AGO1/2蛋白結(jié)合作用的主要功能片段。②Tudor-SN可通過RNA的橋聯(lián)作用與PABP1蛋白結(jié)合，還可與poly(A)+mRNA、AGTR1-3'UTR結(jié)合并共同定位于SGs結(jié)構(gòu)中。
　　第三部分：①與對照組相比，當下調(diào) HeLa細胞內(nèi) Tudor-SN蛋白表達時，SGs顆粒興趣

10、區(qū)光漂白后恢復速率t1/2值由4.35±1.26sec升至7.01±1.55sec（P<0.05），而PBs顆粒興趣區(qū)t1/2值差異無統(tǒng)計學意義。②Tudor-SN基因敲除不能完全阻止但可有效抑制 poly(A)+mRNA應(yīng)激顆粒的形成。③應(yīng)激狀態(tài)下，以放線菌酮或嘌呤霉素干擾多聚核糖體解聚過程可以影響Tudor-SN應(yīng)激顆粒的胞漿組裝，而以siRNA干擾技術(shù)下調(diào)細胞內(nèi)Tudor-SN的表達，并未觀察到多聚核糖體應(yīng)激解聚過程的改變。④利用

11、GFP-MS2系統(tǒng)構(gòu)建pT7-AGTR1-3'UTR-24×MS2重組真核質(zhì)粒，在活細胞內(nèi)成功實現(xiàn)對于AGTR1-3'UTR的GFP標記，后者與Tudor-SN蛋白呈現(xiàn)相同的顆粒組裝過程。當下調(diào)細胞內(nèi) Tudor-SN蛋白表達時，AGTR1-3'UTR顆粒組裝過程受到影響。給予細胞高強度激光漂白處理，AGTR1-3'UTR顆粒興趣區(qū)光漂白后恢復速率 t1/2值由9.96±0.78sec升至16.77±1.94sec（P<0.05）。

12、r>　　結(jié)論：
　　1）Tudor-SN蛋白是一種 SGs特異性蛋白，具有核漿穿梭特性，后者參與Tudor-SN蛋白顆粒呈現(xiàn)高度動態(tài)性的組裝過程。2）Tudor-SN與PABP1、TIAR等多種應(yīng)激蛋白以及poly(A)+mRNA相互作用，形成應(yīng)激蛋白-核酸復合物，共同參與細胞胞漿SGs結(jié)構(gòu)的形成。3）Tudor-SN蛋白對于多聚核糖體的應(yīng)激解聚過程并無影響，但可調(diào)控SGs蛋白-核酸成分（如G3BP蛋白、AGTR1-3'UTR）的