人類γδT細(xì)胞配體分子MutS同源蛋白2-應(yīng)激性膜異位表達(dá)的信號調(diào)控機(jī)制及在細(xì)胞惡變中的膜異位表達(dá).pdf

1、人類γδT細(xì)胞具有天然免疫細(xì)胞特征，可直接識別某些應(yīng)激誘導(dǎo)的、細(xì)胞表面異常表達(dá)的抗原分子并啟動(dòng)γδT細(xì)胞的早期活化，在清除病原體和維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 人MutS同源蛋白2(Human MutS homologue 2，hMSH2)是DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)成員之一，主要在胞漿合成，并在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮DNA損傷的錯(cuò)配修復(fù)作用。hMSH2缺陷或表達(dá)異常多見于各種腫瘤細(xì)胞。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，hMSH2在正常細(xì)胞

2、膜上幾乎不表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞膜表面呈廣泛的異位表達(dá)。這種膜異位表達(dá)能被Epstein-barr病毒(Epstein-barr virus，EBV)感染所誘導(dǎo)。異位表達(dá)的hMSH2可為γδT細(xì)胞受體（γδT cell receptor,TCRγδ）和NK細(xì)胞受體成員2D(Natural killer group 2 member D，NKG2D)雙重識別，從而促進(jìn)γδT細(xì)胞對病毒感染細(xì)胞的清除。然而，目前hMSH2膜異位表達(dá)的調(diào)控方式尚不

3、明確。澄清γδT細(xì)胞應(yīng)激性配體分子膜表達(dá)的分子機(jī)制，將有助于進(jìn)一步揭示γδT細(xì)胞在免疫監(jiān)視中的重要作用。
　　 鑒此，本研究主要針對以下三個(gè)科學(xué)問題展開：一是hMSH2是否為γδT細(xì)胞的應(yīng)激性配體分子？二是hMSH2應(yīng)激性膜異位表達(dá)的信號調(diào)控機(jī)制是什么？三是細(xì)胞惡變過程中，hMSH2的膜異位表達(dá)變化及其對γδT細(xì)胞殺傷惡變細(xì)胞存在什么影響？本文分兩部分就上述三個(gè)科學(xué)問題進(jìn)行研究，證實(shí)了hMSH2是γδT細(xì)胞的應(yīng)激性配體分子，并發(fā)

4、現(xiàn)MAPK家族的p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)通路和應(yīng)激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(Stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase，SAPK-JNK)通路是調(diào)控hMSH2應(yīng)激性膜異位表達(dá)的重要信號通路，初步揭示了細(xì)胞的惡變過程可伴隨著hMSH2膜異位表達(dá)水平升高的規(guī)律性變化。<

5、br>　　 本研究的第一部分包括三項(xiàng)內(nèi)容。第一項(xiàng)內(nèi)容旨在證實(shí)應(yīng)激環(huán)境中，hMSH2在腫瘤細(xì)胞上的膜異位表達(dá)是否具有可誘導(dǎo)性。通過建立熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激等細(xì)胞應(yīng)激模型，分析了hMSH2應(yīng)激時(shí)膜異位表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)檢測結(jié)果表明，hMSH2在腎癌細(xì)胞表面呈低水平的組成性表達(dá);應(yīng)激環(huán)境中，hMSH2膜異位表達(dá)呈不同程度上調(diào)，其中以氧化應(yīng)激誘導(dǎo)hMSH2膜異位趨勢最明顯（從8～10％上調(diào)至40～50％）

6、，而抗氧化劑N.乙酰半胱氨酸（Ⅳ-acetyl-L-cysteine，NAC）能抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的hMSH2膜異位表達(dá)（從40～50％下調(diào)至6～10％），提示hMSH2的膜異位表達(dá)可能被應(yīng)激環(huán)境所誘導(dǎo)。隨后，在幾種對γδT細(xì)胞殺傷作用敏感的血液來源腫瘤細(xì)胞（黑素瘤、淋巴瘤和白血病腫瘤）中，證實(shí)了hMSH2在腫瘤細(xì)胞膜上的異位表達(dá)具有可誘導(dǎo)性。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和免疫

7、印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)hMSH2 mRNA及總蛋白表達(dá)水平升高，提示氧化應(yīng)激可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)hMSH2的表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)，hMSH2與γδT細(xì)胞經(jīng)典的應(yīng)激性配體分子MHC-classⅠ類鏈相關(guān)抗原A/B(MHC-class I chain related A and B，MICA/B)在胞膜的應(yīng)激性表達(dá)上調(diào)趨勢一致，進(jìn)一步證實(shí)了應(yīng)激環(huán)境中，hMSH2在腫瘤細(xì)胞上的膜異位表達(dá)具有可誘導(dǎo)性，提示該分子可能為危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(Dan

8、ger associated molecular pattern，DAMP)家族的成員。
　　 本研究第一部分的第二項(xiàng)工作，是利用腎癌細(xì)胞建立的氧化應(yīng)激模型，探討了hMSH2應(yīng)激性膜異位表達(dá)的信號調(diào)控機(jī)制。Western blot結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激時(shí)MAPK家族的p38-MAPK、SAPK-JNK和絲裂原活化蛋白／胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Mitogen-activated protein/extracellular signal-re

9、gulated kinase，MEK-ERK)通路均處于磷酸化活化狀態(tài)。利用qRT-PCR、FCM和Western blot技術(shù)聯(lián)合三條信號通路特異性抑制劑，對應(yīng)激前后hMSH2 mRNA、膜異位和總蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，初步證實(shí)了p38-MAPK和SAPK-JNK通路主要參與應(yīng)激時(shí)hMSH2膜異位表達(dá)的調(diào)控，而未見MEK/ERK通路發(fā)揮調(diào)控作用。進(jìn)而，當(dāng)促進(jìn)p38-MAPK和SAPK-JNK通路上游共同的結(jié)點(diǎn)激酶——凋亡信號激酶1(Apo

10、ptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)活化時(shí)，hMSH2在腎癌細(xì)胞上的膜異位表達(dá)上調(diào)，驗(yàn)證了上述兩條通路對hMSH2膜異位表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。采用qRT-PCR和Wesetern blot方法，發(fā)現(xiàn)p38-MAPK和SAPK-JNK通路下游的激活轉(zhuǎn)錄因子3(Activating transcription factor 3，ATF3)對氧化應(yīng)激敏感，且hMSH2調(diào)控區(qū)存在ATF3的結(jié)合位點(diǎn)。運(yùn)用小RN

11、A干擾（Small interference RNA，siRNA）技術(shù)靶向敲低腎癌細(xì)胞ATF3表達(dá)時(shí)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的hMSH2膜異位表達(dá)水平明顯降低，而MICA/B的膜表達(dá)變化不明顯，提示氧化應(yīng)激時(shí)ATF3對hMSH2膜異位表達(dá)的調(diào)控作用可能具有特異性。
　　 本研究第一部分的第三項(xiàng)內(nèi)容，旨在進(jìn)一步確定氧化應(yīng)激誘導(dǎo)hMSH2膜異位表達(dá)中關(guān)鍵的影響因素。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent

12、assay,ELISA)，證實(shí)了氧化應(yīng)激能促進(jìn)腎癌細(xì)胞自分泌白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-18。FCM結(jié)果表明，腎癌細(xì)胞組成性表達(dá)IL-18受體α(Interleukin 18 receptorα，IL-18Rα)，且其表達(dá)呈應(yīng)激性上調(diào)。給予腎癌細(xì)胞外源性IL-18作用時(shí)，hMSH2的膜異位表達(dá)上調(diào)。利用siRNA技術(shù)敲低腎癌細(xì)胞IL-18Rα表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞自分泌的IL-18，對hMSH2膜異位表達(dá)發(fā)揮了

13、直接的促進(jìn)作用。運(yùn)用ELISA和胞內(nèi)免疫熒光染色技術(shù)，證實(shí)了氧化應(yīng)激可刺激γδT細(xì)胞分泌干擾素(Interferon，IFN).-γ，且外源性IFN-γ可進(jìn)一步增強(qiáng)hMSH2的應(yīng)激性膜異位表達(dá)。同時(shí)，氧化應(yīng)激、外源性IL-18或IFN-γ作用能有效增強(qiáng)γδT細(xì)胞對腎癌細(xì)胞的殺傷作用。由此，氧化應(yīng)激中γδT細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-7可能上調(diào)hMSH2在腫瘤細(xì)胞上的膜異位表達(dá)，且誘導(dǎo)hMSH2膜異位表達(dá)的因素可促進(jìn)γδT細(xì)胞清除腎癌細(xì)胞。

14、　　 由于hMSH2的膜異位表達(dá)主要存在于上皮及血液來源的腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞表面，因此本研究的第二部分內(nèi)容，分析了腎正常上皮細(xì)胞系HK-2在受到三甲基膽葸（3-methylcholanthrene,3-MCA）誘變時(shí)，hMSH2的膜異位表達(dá)變化。通過分析HK-2細(xì)胞形態(tài)和染色體數(shù)目，利用刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)凝集試驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)，證實(shí)了3-MCA可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生一定程度的惡性轉(zhuǎn)變。同時(shí)，F(xiàn)C

15、M檢測發(fā)現(xiàn)hMSH2膜表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)。在誘變后期，hMSH2的膜表達(dá)在30～40％，且異位表達(dá)的hMSH2促進(jìn)了γδT細(xì)胞對惡變細(xì)胞的殺傷。
　　 綜上，本研究得出以下主要結(jié)論：
　　 1、應(yīng)激環(huán)境可誘導(dǎo)hMSH2在腫瘤細(xì)胞上膜異位表達(dá)上調(diào);
　　 2、氧化應(yīng)激時(shí)p38-MAPK和SAPK-JNK是調(diào)控hMSH2應(yīng)激性膜異位的重要信號通路;
　　 3、氧化應(yīng)激刺激腎癌細(xì)胞自分泌的IL-18和γδT細(xì)胞

16、產(chǎn)生的IFN-γ可促進(jìn)hMSH2在腎癌細(xì)胞上膜異位表達(dá)，并增強(qiáng)γδT細(xì)胞對相應(yīng)靶細(xì)胞的殺傷作用;
　　 4、化學(xué)誘變引發(fā)的細(xì)胞惡變過程可伴隨著hMSH2膜異位表達(dá)上調(diào)。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 1、證實(shí)γδT細(xì)胞配體分子hMSH2具有應(yīng)激性膜異位表達(dá)特征，提示hMSH2可能為DAMP成員，是應(yīng)激環(huán)境中向γδT細(xì)胞預(yù)警的靶標(biāo)分子;
　　 2、首次報(bào)道氧化應(yīng)激時(shí)，p38-MAPK和SAPK-JNK通路為