在位內(nèi)膜LncRNA BANCR表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥惡變的相關(guān)性及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs，簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥）是婦科常見病和疑難病，雖然是良性疾病，卻有惡變傾向。子宮內(nèi)膜異位癥惡變率約1％左右。內(nèi)異癥惡變最高發(fā)部位在卵巢，其中約90％是上皮性惡性腫瘤。異位子宮內(nèi)膜發(fā)生惡變，生長(zhǎng)旺盛的腫瘤組織破壞了起源組織，由于病理取材的局限，內(nèi)異癥惡變發(fā)病率可能被低估。根據(jù)內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制“在位內(nèi)膜決定論”和課題組前期內(nèi)異癥惡變系列研究，提出在位內(nèi)膜基因遺傳學(xué)改變與異位內(nèi)膜惡變同樣具有相關(guān)性。

2、因此，針對(duì)內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜惡變相關(guān)分子標(biāo)志物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并給予早期干預(yù)、及時(shí)以預(yù)防惡變?yōu)槟康闹委焹?nèi)異癥，將對(duì)內(nèi)異癥惡變起到預(yù)防作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA），不能編碼蛋白質(zhì)，長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸單位。研究報(bào)道lncRNA作為一種功能性RNA分子，其可從表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平等多方面調(diào)控基因表達(dá)，誘發(fā)腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展。前期已利用LncRNA/mRNA芯片對(duì)Ⅰ型內(nèi)膜癌癌組

3、織進(jìn)行LncRNA表達(dá)譜篩查及組織驗(yàn)證，LncRNA BANCR是其中明顯上調(diào)的LncRNA之一。而卵巢子宮內(nèi)膜異位癥惡變與子宮內(nèi)膜癌在臨床、病理特點(diǎn)及分子異常等方面存在顯著相關(guān)性，同時(shí)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LncRNA BANCR在內(nèi)異癥惡變癌組織中表達(dá)明顯升高，推測(cè)LncRNA BANCR可能同樣參與內(nèi)異癥惡變的發(fā)生。因此，本研究從在位內(nèi)膜LncRNA BANCR表達(dá)改變?nèi)胧?，通過(guò)組織和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究BANCR表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥惡變

4、的相關(guān)性、生物學(xué)作用及可能調(diào)控機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)利用內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜，預(yù)測(cè)異位內(nèi)膜惡變的風(fēng)險(xiǎn)提供新思路。
　　方法：利用顯微切割技術(shù)、石蠟組織提取RNA、實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)LncRNA BANCR在內(nèi)異癥惡變中的表達(dá)情況，分析LncRNA BANCR與內(nèi)異癥惡變患者臨床病理特征的關(guān)系。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用子宮內(nèi)膜細(xì)胞原代培養(yǎng)、慢病毒感染、RNA干擾等技術(shù)構(gòu)建過(guò)BANCR表達(dá)及敲低細(xì)胞模型，利用CCK-8、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transw

5、ell侵襲試驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)等全面驗(yàn)證BANCR對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，明確在位內(nèi)膜BANCR改變?cè)诋愇蛔訉m內(nèi)膜發(fā)生惡變中的作用。利用生物信息學(xué)CNC共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析BANCR的候選調(diào)控基因，利用免疫組化方法檢測(cè)候選調(diào)控基因在內(nèi)異癥惡變及其在位內(nèi)膜中的表達(dá)情況，分析BANCR表達(dá)與候選調(diào)控基因之間表達(dá)相關(guān)性。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及蛋白免疫印跡等技術(shù)分析BANCR對(duì)候選基因的調(diào)控關(guān)系，利用蛋白免疫印跡、CCK-8、劃痕和Tran

6、swell等技術(shù)檢測(cè)BANCR對(duì)ERK/MAPK信號(hào)通路激活的影響，明確BANCR參與內(nèi)異癥惡變的可能作用機(jī)制。
　　結(jié)果：⑴惡變癌組織LncRNA BANCR表達(dá)水平明顯高于其在位內(nèi)膜組織(P＜0.05);惡變癌組織BANCR表達(dá)水平明顯高于內(nèi)異癥組異位內(nèi)膜(P＜0.05)。在卵巢內(nèi)異癥組中，異位內(nèi)膜組織與其在位內(nèi)膜組織中BANCR表達(dá)水平之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。BANCR在內(nèi)異癥惡變組的在位內(nèi)膜中表達(dá)水平顯著高

7、于內(nèi)異癥組在位內(nèi)膜（P＜0.05），也高于正常內(nèi)膜組織（P＜0.05）。在內(nèi)異癥惡變中，LncRNA BANCR表達(dá)水平與患者年齡及病理學(xué)類型無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），即卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌及卵巢透明細(xì)胞癌中BANCR表達(dá)水平無(wú)明顯差異。而LncRNA BANCR表達(dá)與內(nèi)異癥惡變患者FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，其中，BANCR在FIGOⅠ期與Ⅱ-Ⅳ期之間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，同時(shí)，BANCR在FIGOⅠ a

8、期與Ⅰc期之間的表達(dá)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)結(jié)果顯示:感染BANCR過(guò)表達(dá)慢病毒的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞(EUC-BANCR)中BANCR表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照(NC)及空白對(duì)照(control)（P＜0.05），轉(zhuǎn)染si-BANCR組Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞中BANCR表達(dá)水平均明顯減低(P＜0.05)，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功;CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照及

9、陰性對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)BANCR組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖能力明顯增高(P＜0.05)，敲低BANCR組Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞增殖能力明顯減低（P＜0.05）;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)BANCR組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞遷移能力明顯增高(P＜0.05)，敲低BANCR組Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞遷移能力明顯減低（P＜0.05）;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)BANCR組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞侵襲能力明顯增高(P＜0.0

10、5)，敲低BANCR組Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞侵襲能力明顯減低(P＜0.05);流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)BANCR組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞G0/G1期比例明顯減少，而S期比例明顯增加(P＜0.01)，敲低BANCR組Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞G0/G1期比例明顯增加（P＜0.05），S期比例明顯減少（P＜0.05）;AnnexinⅤ/APC分析細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)BANCR組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率明顯減低(P＜

11、0.01);蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)BANCR組，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞中Cyclin D1、Bcl-2及Vimentin表達(dá)增高(P＜0.05)，E-cadherin減低（P＜0.05）。⑵對(duì)LncRNA BANCR進(jìn)行生物信息學(xué)CNC(Coding-non-coding)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果提示MMP1、MMP2和PTK2/FAK可能與BANCR存在共表達(dá)關(guān)系(Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.9

12、9、0.988和0.987，P＜0.05）;免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:卵巢內(nèi)異癥惡變組癌灶組織MMP2、MMP1及PTK2/FAK蛋白陽(yáng)性率顯著高于其在位內(nèi)膜(P＜0.05)，同時(shí)，卵巢內(nèi)異癥惡變?cè)谖粌?nèi)膜MMP2、MMP1及PTK2/FAK蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組及正常內(nèi)膜組(P＜0.05);利用Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，BANCR表達(dá)與MMP2、 MMP1及PTK2/FAK陽(yáng)性率成正相關(guān)(P＜0.01);熒光定量

13、PCR和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MMP2、MMP1及PTK2/FAK mRNA和蛋白水平在過(guò)表達(dá)BANCR的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞(EUC-BANCR)中明顯增高（P＜0.05）;與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)BANCR的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞中，P-ERK/ERK和P-ATK/AKT比值明顯增高(P＜0.05)，而ERK和AKT表達(dá)不改變，其中P-ERK蛋白表達(dá)水平差異更顯著，提示BANCR激活ERK/MAPK通路更為顯著;加入ERK

14、特異性抑制劑U0126后，P-ERK水平顯著減低，與單獨(dú)過(guò)表達(dá)BANCR相比，同時(shí)加入U(xiǎn)0126的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力明顯減低（P＜0.01），同時(shí)可逆轉(zhuǎn)BANCR對(duì)MMP1和MMP2的上調(diào)作用，提示BANCR可通過(guò)激活ERK/MAPK通路進(jìn)而影響內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)特性，促進(jìn)異位內(nèi)膜惡變的發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)論：①LncRNA BANCR在卵巢內(nèi)異癥惡變癌組織及其在位內(nèi)膜中高表達(dá)，LncRNA BANCR表達(dá)與卵巢內(nèi)異癥

15、惡變患者FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，在位內(nèi)膜LncRNA BANCR表達(dá)與卵巢子宮內(nèi)膜異位癥惡變的發(fā)生及疾病進(jìn)展密切相關(guān)。LncRNA BANCR可能通過(guò)上調(diào)Cyclin D1、Bcl-2表達(dá)促進(jìn)在位內(nèi)膜增殖抑制凋亡;BANCR可能通過(guò)上調(diào)Vimentin、下調(diào)E-cadherin促進(jìn)EMT發(fā)生增強(qiáng)在位內(nèi)膜細(xì)胞遷移侵襲能力;LncRNA BANCR可通過(guò)影響內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖凋亡和遷移侵襲等生物學(xué)特性，參與內(nèi)異癥惡變的發(fā)生