Tc17細(xì)胞在胃癌中的表達(dá)調(diào)控及作用機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是全球死亡率第二的惡性腫瘤并且預(yù)后不良。胃癌的臨床轉(zhuǎn)歸受到腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞間的調(diào)控影響,其中免疫抑制性微環(huán)境的形成和持續(xù)與胃癌的進(jìn)展及其治療效果的不佳直接相關(guān)。
　　胃癌實(shí)體瘤的細(xì)胞組成除了惡變的癌細(xì)胞外,還包括腫瘤微環(huán)境中固有存在的以及遷移到腫瘤微環(huán)境中來(lái)的非癌性細(xì)胞。在轉(zhuǎn)基因小鼠背景下的腫瘤誘導(dǎo)模型中,最近發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞的最初惡性化可以被微環(huán)境中的其他非癌性細(xì)胞特別是免疫細(xì)胞所調(diào)控。因此,目前認(rèn)為,免疫細(xì)胞所調(diào)控的微環(huán)境

2、與腫瘤的生物學(xué)活動(dòng)密切相關(guān),并認(rèn)為這些免疫細(xì)胞很可能將成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。
　　T淋巴細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的主要組成部分。近來(lái),在人體腫瘤中發(fā)現(xiàn)了一群具有促炎癥效應(yīng)的產(chǎn)IL-17的T細(xì)胞。這群細(xì)胞又可被進(jìn)一步分為CD4+(Th17細(xì)胞)和CD8+(Tc17細(xì)胞)的產(chǎn)IL-17的T細(xì)胞這兩個(gè)亞群。在體外,Tc17細(xì)胞可在Th17細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子如IL-23的誘導(dǎo)下分化而成;雖然Tc17細(xì)胞表現(xiàn)出減弱的細(xì)胞毒活性,但在某些小

3、鼠模型中卻發(fā)揮了對(duì)抗流感病毒感染和腫瘤發(fā)生的保護(hù)作用。另一方面,在獼猴和黑白瞼猴等哺乳動(dòng)物的猴類免疫缺陷病毒感染模型中,Tc17細(xì)胞則發(fā)揮了促進(jìn)病程的病理?yè)p傷作用。特別值得注意的是,在人胃癌中,Tc17細(xì)胞的分布、表型、分化調(diào)控及功能機(jī)制和臨床意義至今尚未明確。
　　單核/巨噬細(xì)胞和髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中影響抗腫瘤免疫效應(yīng)的兩類重要的免疫細(xì)胞類型。單核細(xì)胞可以對(duì)CSF-1和IL-6等腫瘤誘導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)分子做出反應(yīng),并能

4、分泌Th17細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子,繼而介導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。那么,現(xiàn)仍不清楚在胃癌中是否存在著這樣一種單核細(xì)胞所介導(dǎo)的Tc17細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制。現(xiàn)認(rèn)為,髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞則可直接抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。更有趣的是,在小鼠模型中,促炎癥細(xì)胞因子IL-17可以調(diào)控髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞,但其具體的機(jī)制及其在人體腫瘤特別是胃癌中相關(guān)機(jī)理仍有待闡明。
　　【研究目的】
　　1.明確Tc17細(xì)胞在胃癌中的分布和表型特征;

5、r>　　2.探討Tc17細(xì)胞在胃癌中的分化發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制;
　　3.闡明Tc17細(xì)胞在胃癌中的功能機(jī)制和臨床意義。
　　【研究方法】
　　1. Tc17細(xì)胞在胃癌中的分布及表型特征
　　在第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院普外科收集胃癌病人新鮮外周血和組織標(biāo)本。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光雙染和免疫組化雙染檢測(cè)Tc17細(xì)胞的分布情況。H&E染色明確胃組織病理學(xué)情況。流式細(xì)胞術(shù)分析Tc17細(xì)胞表型;并分析腫瘤微環(huán)境中Tc17細(xì)

6、胞與其他免疫細(xì)胞的相關(guān)性。
　　2. Tc17細(xì)胞在胃癌中的分化發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制
　　分選同一胃癌病人新鮮外周血單核細(xì)胞,正常非腫瘤胃組織及腫瘤組織浸潤(rùn)單核細(xì)胞。條件性外周血單核細(xì)胞由50％腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)上清、腫瘤組織培養(yǎng)上清、正常細(xì)胞系培養(yǎng)上清或非腫瘤正常組織培養(yǎng)上清與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)所得。收集單核細(xì)胞培養(yǎng)上清和單核細(xì)胞用于ELISA和表面標(biāo)志流式染色檢測(cè)。
　　在5天的共培養(yǎng)體系中,磁珠分選純化的外周血CD8+

7、T細(xì)胞先標(biāo)記上CFSE,再以2比1的比例與同一胃癌病人外周血單核細(xì)胞、正常非腫瘤胃組織及腫瘤組織浸潤(rùn)單核細(xì)胞,或者腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)上清、腫瘤組織培養(yǎng)上清、正常細(xì)胞系培養(yǎng)上清或非腫瘤正常組織培養(yǎng)上清作用后的同一病人的條件性外周單核細(xì)胞共培養(yǎng);或者在有重組人 IL-6、IL-23和/或 IL-1β的條件下與同一胃癌病人外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng);或者在有抗人 IL-6、IL-23和/或 IL-1β中和抗體的條件下與同一胃癌病人的腫瘤組織浸潤(rùn)單核細(xì)胞

8、共培養(yǎng)。5天后,收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞分別用于ELISA和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式染色檢測(cè)。
　　3. Tc17細(xì)胞在胃癌中的功能機(jī)制及臨床意義
　　分選TNM分期Ⅰ期的胃癌病人原代腫瘤細(xì)胞,并用重組人IL-17、IL-22、IFN-γ、IL-17與IL-22組合及100%Tc17細(xì)胞分化培養(yǎng)上清刺激;某些培養(yǎng)孔中加抗IL-17和/或IL-22的中和抗體。收集培養(yǎng)上清用于ELISA和趨化試驗(yàn)。
　　收集刺激后的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作

9、為趨化吸引液。流式分選的腫瘤浸潤(rùn)的髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞置于Transwell板的上室。趨化因子CXCL12和趨化吸引液置于下室。通過計(jì)算下室中和附著于通透膜底部的細(xì)胞數(shù)量總和來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移變化。在某些情況下,事先將髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞與抗 CXCR4的中和抗體孵育后再進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)。
　　純化的外周 CD8+T細(xì)胞用CFSE標(biāo)記后再與同一胃癌病人的同樣數(shù)量的去除CD8+T細(xì)胞的外周血單個(gè)核細(xì)胞(事先用絲裂霉素C處理)共培養(yǎng)。再在上

10、述培養(yǎng)體系中以1比1比例加入流式分選所得的同一胃癌病人的腫瘤組織浸潤(rùn)的髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞。在Transwell實(shí)驗(yàn)中,CFSE標(biāo)記的CD8+T細(xì)胞與裂霉素C處理的飼養(yǎng)細(xì)胞以1比1的比例置于下室,同一胃癌病人的腫瘤組織浸潤(rùn)的髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞則置于上室或者下室。培養(yǎng)5天后,收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞分別用于ELISA和流式染色檢測(cè)。
　　胃癌病人總生存率以手術(shù)當(dāng)天算起,直到死亡或者最后一次隨訪。累計(jì)的生存時(shí)間用Kaplan-Meier方

11、法計(jì)算?？偵媛实母黝愵A(yù)后影響因子的多變量分析用Cox比例危險(xiǎn)率模型進(jìn)行分析。
　　【研究結(jié)果】
　　1. Tc17細(xì)胞在胃癌中的分布及表型特征
　　1.1胃癌病人外周血中Tc17細(xì)胞百分率較正常人外周血的顯著增高。就胃癌病人本身,腫瘤組織中 Tc17細(xì)胞百分率較其他組織顯著增高。隨著腫瘤進(jìn)展,Tc17細(xì)胞百分率在各個(gè)組織(腫瘤引流淋巴結(jié)除外)中均顯著增高。就腫瘤組織而言,Tc17細(xì)胞從Ⅱ期腫瘤以后則隨著分期進(jìn)展逐漸增

12、高。如以每1,000,000個(gè)總細(xì)胞中Tc17細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量來(lái)統(tǒng)計(jì)分析,也得到上述相同的結(jié)論。
　　1.2通過免疫熒光和免疫組化雙染發(fā)現(xiàn),Tc17細(xì)胞在腫瘤組織明顯浸潤(rùn)。上述結(jié)果提示,Tc17細(xì)胞在胃癌微環(huán)境中浸潤(rùn)增高。
　　1.3胃癌組織中浸潤(rùn)的Tc17細(xì)胞基本不共表達(dá)IFN-γ、IL-4、 IL-10或 IL-9等細(xì)胞因子,但共表達(dá)IL-22及 IL-17F;腫瘤內(nèi)Tc17細(xì)胞也不共表達(dá)HLA-DR或CD25等與T細(xì)胞激

13、活相關(guān)的表面分子,亦不共表達(dá)perforin或GrB等與細(xì)胞毒效應(yīng)和FoxP3或 PD-1等與免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制相關(guān)的分子。腫瘤組織、癌旁組織及正常非腫瘤胃組織浸潤(rùn)的Tc17細(xì)胞表現(xiàn)出 CD27-CD45RA-效應(yīng)/記憶型,腫瘤引流淋巴結(jié)和外周血Tc17細(xì)胞則分別表現(xiàn)出CD27+CD45RA-記憶型和CD27+CD45RA+初始型。在腫瘤微環(huán)境中,Tc17細(xì)胞與產(chǎn)IL-22的T細(xì)胞、Th17細(xì)胞及CD14+腫瘤相關(guān)單核細(xì)胞成正相關(guān),而與

14、其他T細(xì)胞亞群及CD56+自然殺傷細(xì)胞則無(wú)明顯相關(guān)性。
　　2. Tc17細(xì)胞在胃癌中的分化發(fā)育及調(diào)控機(jī)制
　　2.1 T細(xì)胞-單核細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),相比外周血單核細(xì)胞和正常非腫瘤胃組織浸潤(rùn)的單核細(xì)胞,腫瘤相關(guān)單核細(xì)胞可以顯著誘導(dǎo)外周CD8+T細(xì)胞向Tc17細(xì)胞分化和IL-17產(chǎn)生,并能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖。此外,腫瘤相關(guān)單核細(xì)胞表面CD80、CD86和HLA-DR等共刺激分子的表達(dá)也較外周血單核細(xì)胞和正常非腫瘤胃組織浸

15、潤(rùn)的單核細(xì)胞顯著增高。
　　2.2相比正常細(xì)胞系培養(yǎng)上清和非腫瘤正常組織培養(yǎng)上清作用后的外周單核細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)上清及腫瘤組織培養(yǎng)上清作用后的外周單核細(xì)胞顯著高表達(dá)CD80、CD86和HLA-DR等共刺激分子,并能顯著誘導(dǎo)外周CD8+T細(xì)胞向Tc17細(xì)胞分化和IL-17產(chǎn)生,并能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖。上述結(jié)果提示,腫瘤微環(huán)境可以激活其中的單核細(xì)胞,后者進(jìn)而誘導(dǎo)Tc17細(xì)胞分化。
　　2.3相比外周血單核細(xì)胞和正常非腫瘤

16、胃組織浸潤(rùn)的單核細(xì)胞,腫瘤相關(guān)單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β和IL-23的水平顯著增高。相比正常細(xì)胞系培養(yǎng)上清和非腫瘤正常組織培養(yǎng)上清作用后的外周單核細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)上清及腫瘤組織培養(yǎng)上清作用后的外周單核細(xì)胞的培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β和IL-23的水平亦顯著增高。在外周CD8+T細(xì)胞與腫瘤相關(guān)單核細(xì)胞的培養(yǎng)體系中,單獨(dú)或者聯(lián)合使用抗IL-6、IL-1β或/和IL-23抗體阻斷其生物學(xué)功能后,Tc17細(xì)胞分化和IL-17

17、產(chǎn)生水平則明顯降低。在外周CD8+T細(xì)胞與外周單核細(xì)胞的培養(yǎng)體系中,單獨(dú)或者聯(lián)合使用重組IL-6、IL-1β或/和IL-23增強(qiáng)其生物學(xué)功能后,Tc17細(xì)胞分化和IL-17產(chǎn)生水平則明顯增高。上述結(jié)果提示,IL-6、IL-1β或/和IL-23在體外單核細(xì)胞誘導(dǎo)的Tc17細(xì)胞分化調(diào)控中發(fā)揮了重要作用,并進(jìn)一步提示在體內(nèi)Tc17細(xì)胞分化存在相似的調(diào)控機(jī)制。
　　3. Tc17細(xì)胞在胃癌中的功能機(jī)制及臨床意義
　　3.1相比癌旁組

18、織和非腫瘤正常組織,髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞在 CD45+細(xì)胞中的百分率在腫瘤組織則明顯增高,并與Tc17細(xì)胞百分率成正相關(guān)。同時(shí),腫瘤組織浸潤(rùn)的髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞基本不表達(dá) IL-17受體、趨化因子受體 CCR4、CCR6或CXCR3,但卻高表達(dá)趨化因子受體 CXCR4。相反,癌旁組織和非腫瘤正常組織中表達(dá) CXCR4的髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞則相對(duì)顯著降低。上述結(jié)果提示,髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞很可能是通過CXCR4介導(dǎo)的趨化作用浸潤(rùn)到腫瘤微

19、環(huán)境中。
　　3.2在腫瘤組織內(nèi)Tc17細(xì)胞與CXCR4的配體即趨化因子CXCL12成正相關(guān);胃癌腫瘤細(xì)胞則高表達(dá)IL-17受體,IL-17能劑量依賴性刺激誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生CXCL12。腫瘤相關(guān)單核細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞衍生的Tc17細(xì)胞培養(yǎng)上清(而非外周血單核細(xì)胞和正常非腫瘤胃組織浸潤(rùn)的單核細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞衍生的培養(yǎng)上清)同樣也能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生CXCL12,這種誘導(dǎo)效應(yīng)可以被抗IL-17中和抗體所阻斷。上述結(jié)果提示,Tc17

20、細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子CXCL12。
　　3.3髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)顯示,相比外周血單核細(xì)胞和正常非腫瘤胃組織浸潤(rùn)的單核細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞衍生的培養(yǎng)上清所刺激的腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清,腫瘤相關(guān)單核細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞衍生的Tc17細(xì)胞培養(yǎng)上清所刺激的腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清能顯著誘導(dǎo)髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞趨化,這種誘導(dǎo)效應(yīng)可以被抗IL-17中和抗體或者抗CXCR4中和抗體所阻斷。上述結(jié)果提示,Tc17細(xì)胞產(chǎn)生

21、的IL-17能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子CXCL12,后者可以進(jìn)而趨化髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境中。
　　3.4髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞可以抑制CD8~+T細(xì)胞增殖、IFN-γ的產(chǎn)生和perforin/GrB的表達(dá)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞的這種抑制效應(yīng)是通過細(xì)胞間相互接觸而發(fā)揮的，表明髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞通過細(xì)胞間相互接觸的機(jī)制發(fā)揮了抑制CD8~+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抗腫瘤作用。
　　3.5Tc17細(xì)胞

22、百分率與癌胚抗原的表達(dá)、淋巴管的侵襲和血管的侵襲正相關(guān)。通過Tc17細(xì)胞百分率的中位數(shù)(2.75%)把胃癌病人分為2組，21月為隨訪周期的生存分析顯示，高Tc17細(xì)胞百分率的病人組的生存率顯著低于低Tc17細(xì)胞百分率的病人組。如以Tc17細(xì)胞絕對(duì)數(shù)來(lái)統(tǒng)計(jì)分析也可得到相同的結(jié)論。更重要的是，運(yùn)用Cox比例危險(xiǎn)率模型的多變量分析來(lái)評(píng)估總生存率的各類預(yù)后影響因子揭示，腫瘤內(nèi)Tc17細(xì)胞百分率可以獨(dú)立預(yù)測(cè)胃癌病人的預(yù)后及生存。
　　【結(jié)論

23、】1. Tc17細(xì)胞，具有自己獨(dú)特的細(xì)胞因子和生物學(xué)功能分子的表型表達(dá)譜，主要在胃癌病人的腫瘤組織中浸潤(rùn)。2.腫瘤激活的單核細(xì)胞分泌IL-6、IL-1β和IL-23，進(jìn)而誘導(dǎo)調(diào)控Tc17細(xì)胞分化。3. Tc17細(xì)胞的分化上清可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子CXCL12，后者通過與CXCR4作用促進(jìn)髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞趨化，髓樣來(lái)源的抑制性細(xì)胞又通過細(xì)胞間相互接觸的機(jī)制發(fā)揮抑制CD8~+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抗腫瘤作用。4.腫瘤內(nèi)Tc17細(xì)胞百分率