miR-181a在胃癌細(xì)胞SGC-7901中表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、背景：microRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度在21個(gè)核苷酸左右的，細(xì)胞中重要的調(diào)控型非編碼RNA，miRNA在基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工、細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育、遺傳和表觀遺傳等幾乎所有的重要生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。成熟miRNA的形成過包含若干步驟，首先，RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子指導(dǎo)microRNA基因轉(zhuǎn)錄成初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄體（pri-miRNA前體），經(jīng)由Drosha和Dicer兩類核酸酶Ⅲ順序加工和Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)，從而分別產(chǎn)生約8

2、0nt的pre-miRNA前體和約21nt的成熟miRNA，成熟miRNA與RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合，從而識(shí)別并通過翻譯阻遏或直接切割來沉默靶基因。理論上，在上述miRNA轉(zhuǎn)錄、剪切加工過程中的任一環(huán)節(jié)發(fā)生改變，均有可能導(dǎo)致其最終表達(dá)水平的變化，并影響其功能。在miRNA的轉(zhuǎn)錄水平，其表達(dá)主要受啟動(dòng)子序列突變、啟動(dòng)子表觀遺傳學(xué)變化（甲基化或組蛋白乙?；阶兓?、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化等因素的影響；在轉(zhuǎn)錄后水平，miRNAs的表

3、達(dá)主要與其基因序列變異及剪切酶（Drosha，Dicer及其輔助分子等）和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Exportin-5）功能相關(guān)。越來越多的證據(jù)已顯示miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在癌腫組織中存在異常表達(dá)，其中在癌腫中表達(dá)上調(diào)、有促進(jìn)癌腫生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移作用者被稱為致癌miRNAs；而在癌腫中表達(dá)下調(diào)、有抑制癌腫生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移作用者被稱為抑癌miRNAs。我們的前期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了miR-181a在胃癌組織中高表達(dá)，當(dāng)用RNA干擾技術(shù)抑制胃癌細(xì)胞

4、系SGC7901中miR-181a的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力顯著下降，而凋亡卻增加，這提示miR-181a可能是人類胃癌的一種新的癌基因。然而迄今，miR-188a在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CCAAT/enhancer binding protein beta, C/EBPβ），也稱作核因子白細(xì)胞介素-6（NF-IL6），是轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBPs）家族的第二位

5、成員。C/EBPs是核轉(zhuǎn)錄因子，既參與正常的生理代謝過程，又與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，其作用方式多樣，對(duì)轉(zhuǎn)錄有正、負(fù)調(diào)控作用。C/EBPβ主要通過對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞的增殖與分化、腫瘤發(fā)生與凋亡、機(jī)體炎癥反應(yīng)等重要生命活動(dòng)。有研究表明在HepG2和HepG3β肝癌細(xì)胞系、卵巢癌細(xì)胞系、乳腺癌細(xì)胞系和皮膚癌細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)有C/EBPβ表達(dá)增強(qiáng)，并且C/EBPβ具有增強(qiáng)癌基因Ha-Ras的轉(zhuǎn)化能力，促進(jìn)腫瘤的生成；然而也有報(bào)道認(rèn)為

6、C/EBPβ參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡過程，過表達(dá)的C/EBPβ可以通過激活細(xì)胞凋亡因子p53和p21而誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞瘤的凋亡。這些結(jié)果提示C/EBPβ可通過對(duì)癌基因或抑癌基因的調(diào)控作用來決定腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)：既參與腫瘤生成，又與腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。
　　目的：本研究聯(lián)合運(yùn)用TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR方法，快速擴(kuò)增cDNA5’端（5’RACE）法，雙熒光素酶報(bào)告基因分析，染色體免疫沉淀（CHIP）以及RNA干擾等技術(shù)確定miR-181a前體

7、的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、定位核心啟動(dòng)子區(qū)，然后利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其反式作用因子，并驗(yàn)證目的DNA元件與DAN結(jié)合蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合的能力，最后在細(xì)胞中證明轉(zhuǎn)錄因子對(duì)miR-181a前體和成熟體表達(dá)的影響，從而在轉(zhuǎn)錄水平闡述miR-181a表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　方法：⑴TaqMan?實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)胃癌和癌旁組織、胃癌細(xì)胞系中成熟miR-181a和其初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-181a-1和pri-miR-181a-2）的表達(dá)情況

8、。⑵將特異性引物與pri-miR-181a-1進(jìn)行雜交，利用反轉(zhuǎn)錄酶延伸到RNA分子的5’端，然后進(jìn)行cDNA第一鏈的PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物克隆到載體并測(cè)序，揭示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置。⑶提取SGC-7901細(xì)胞總DNA為模板，利用10對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲取miR-181a-15’側(cè)翼區(qū)不同長(zhǎng)度的10個(gè)片段，分別為﹢379~﹢616 bp、﹢140~﹢616 bp、﹣37~﹢616 bp、﹣165~﹢616 bp、﹣295~﹢616 bp、

9、﹣609~﹢616 bp、﹣994~﹢616 bp、﹣1419~﹢616 bp、﹣1779~﹢616 bp、﹣2022~﹢616 bp。將目的片段與載體連接，轉(zhuǎn)化，構(gòu)建miR-181a-1 pro1~10質(zhì)粒。利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系列質(zhì)粒miR-181a-1 pro1~10，確定miR-181a-1啟動(dòng)子的核心區(qū)域。⑷運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)pri-miR-181a-1啟動(dòng)子區(qū)功能組件及其反式作用因子，通過染色體免疫沉淀（CHIP）技

10、術(shù)驗(yàn)證目的DNA元件與轉(zhuǎn)錄因子（C/EBPβ）的結(jié)合能力。⑸轉(zhuǎn)染C/EBPβ siRNA入SGC-7901細(xì)胞后檢測(cè)pri-miR-181a-1和成熟miR-181a，從而進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ對(duì)miR-181a前體和成熟體表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：①在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中，成熟miR-181a和前體pri-miR-181a-1的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P<0.05），且兩者之間呈正相關(guān)。其中在SGC-7901細(xì)胞系中兩者的

11、相對(duì)表達(dá)量最高。②轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于miR-181a-15’端上游第677個(gè)堿基處。與空載體相比， miR-181a-1pro1~10的相對(duì)熒光素酶活性均明顯增強(qiáng)，且﹣37~﹢616 bp的相對(duì)活性熒光值最高，說明核心啟動(dòng)子區(qū)位于﹣37~﹢140bp區(qū)段。③生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示C/EBPβ能與核心啟動(dòng)子及其前區(qū)多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合。CHIP結(jié)果也證明了C/EBPβ能與預(yù)測(cè)靶序列有效結(jié)合。④C/EBPβ siRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞系后，成

12、功降低了細(xì)胞中C/EBPβ mRNA和蛋白的表達(dá)后，pri-miR-181a-1和成熟miR-181a的相對(duì)表達(dá)量也明顯下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴成熟miR-181a的初級(jí)轉(zhuǎn)錄體包括pri-miR-181a-1和pri-miR-181a-2，但主要由pre-miR-181a-1轉(zhuǎn)錄加工產(chǎn)生成熟miR-181a。⑵C/EBPβ通過與核心啟動(dòng)子區(qū)的特定DNA序列結(jié)合，調(diào)控pre-miR-181a-1的轉(zhuǎn)錄，從而在轉(zhuǎn)錄階段調(diào)控