人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)及蛻膜NK細(xì)胞功能的分子機(jī)制.pdf

1、妊娠是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程。從免疫學(xué)角度，妊娠是一種同種異體移植現(xiàn)象，流產(chǎn)是移植排斥的結(jié)果，在正常妊娠過(guò)程中，母體對(duì)攜帶父系抗原的胚胎不僅不排斥，而且通過(guò)精細(xì)的母-胎對(duì)話建立獨(dú)特的母-胎界面免疫耐受微環(huán)境，允許胎兒在子宮內(nèi)生長(zhǎng)知道分娩。因此對(duì)于母-胎界面免疫耐受的研究對(duì)于人類自然流產(chǎn)等妊娠疾患的防治具有重要意義。
　　母-胎界面主要包括滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜腺上皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞。其中70％以上的蛻膜免疫細(xì)胞為CD56brig

2、htCD16-NK細(xì)胞。本研究通過(guò)解析母-胎界面功能細(xì)胞對(duì)外周和蛻膜NK細(xì)胞功能性發(fā)育過(guò)程，以及CXCL12/CXCR4信號(hào)在其中的調(diào)節(jié)作用，以探討母-胎界面NK細(xì)胞功能調(diào)控的機(jī)制。
　　第一部分人外周NK與蛻膜腿的功能表型
　　目的評(píng)價(jià)外周NK與蛻膜NK的表型及功能差異
　　方法收集正常非孕育齡期婦女外周血，正常早孕婦女蛻膜組織，采用流式細(xì)胞術(shù)分析外周及蛻膜免疫細(xì)胞中NK細(xì)胞的表型、細(xì)胞因子的表達(dá)以及細(xì)胞毒活性。

3、r>　　結(jié)果相對(duì)于蛻膜NK細(xì)胞，外周NK細(xì)胞高表達(dá)激活性受體CD16，NKp44，低表達(dá)抑制性受體KIR2DL1;高表達(dá)Th1型細(xì)胞因子TNF-α，低表達(dá)Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10;穿孔素表達(dá)和細(xì)胞毒活性高于蛻膜NK細(xì)胞。
　　結(jié)論外周NK細(xì)胞呈現(xiàn)激活表型，而蛻膜NK細(xì)胞呈現(xiàn)抑制表型。
　　第二部分人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)外周及蛻膜NK細(xì)胞表型及功能
　　目的解析人早孕母-胎界面功能細(xì)胞對(duì)外周及蛻膜N

4、K細(xì)胞表型及功能的調(diào)節(jié)作用
　　方法滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞或滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系與外周NK細(xì)胞、蛻膜NK細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞的表型和細(xì)胞因子的表達(dá)，細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
　　結(jié)果早孕滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對(duì)外周NK細(xì)胞的趨化因子受體CXCR4和CCR2表達(dá)沒(méi)有明顯影響，而二者均顯著降低蛻膜NK細(xì)胞表面趨化因子受體CCR2的表達(dá)(P＜0.05);盡管滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)蛻膜NK細(xì)胞CXC

5、R4的表達(dá)沒(méi)有影響，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)即可上調(diào)蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞百分率(P＜0.05)。母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞顯著下調(diào)外周NK細(xì)胞CD16分子的表達(dá)(P＜0.05)。滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合均可下調(diào)外周NK細(xì)胞殺傷性受體NKp44的表達(dá)。滋養(yǎng)細(xì)胞顯著下調(diào)外周與蛻膜局部NK細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá);滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)或共培養(yǎng)均不能改變外周或蛻膜局部NK細(xì)胞的IFN-γ的表達(dá)水平。滋養(yǎng)細(xì)胞顯著上調(diào)外周及蛻膜局部N

6、K細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10的表達(dá);而蛻膜基質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)蛻膜NK細(xì)胞的IL-4與IL-10的表達(dá)水平，但對(duì)外周NK細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)沒(méi)有明顯影響。滋養(yǎng)細(xì)胞能夠降調(diào)節(jié)外周及蛻膜局部NK細(xì)胞穿孔素perforin表達(dá)與其細(xì)胞毒活性;蛻膜基質(zhì)細(xì)胞可降低外周NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，但對(duì)perforin的表達(dá)沒(méi)有影響。蛻膜基質(zhì)細(xì)胞也不影響滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)論母-胎界面功能細(xì)胞能夠誘導(dǎo)外周及蛻膜NK細(xì)胞

7、的耐受表型及Th2型優(yōu)勢(shì)，下調(diào)外周及蛻膜NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，從而有利于形成母-胎界面免疫耐受微環(huán)境。
　　第三部分 CXCL12/CXCR4信號(hào)參與滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)外周及蛻膜NK細(xì)胞的功能
　　目的解析CXCL12/CXCR4調(diào)節(jié)母-胎界面功能細(xì)胞對(duì)外周及蛻膜NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)機(jī)制
　　方法 ELISA方法檢測(cè)人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜基質(zhì)細(xì)胞分泌CXCL12。檢測(cè)人重組CXCL12，以及人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜基質(zhì)

8、細(xì)胞上清液對(duì)外周NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。CXCR4拮抗劑預(yù)處理外周NK及蛻膜NK細(xì)胞，再與母-胎界面功能細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞的表型和細(xì)胞因子的表達(dá)，細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
　　結(jié)果母-胎界面CXCL12主要由人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞分泌，CXCL12以劑量依賴性抑制外周NK細(xì)胞的穿孔素表達(dá)與殺傷活性，這種作用可被CXCR4拮抗劑所逆轉(zhuǎn)。阻斷了CXCL12/CXCR4信號(hào)通路，能夠抑制人早孕母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞與

9、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對(duì)外周及蛻膜NK細(xì)胞的表面受體、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子以及殺傷活性的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)論早孕母-胎界面功能細(xì)胞對(duì)外周NK及蛻膜NK的調(diào)節(jié)作用主要由SDF-1/CXCR4信號(hào)通路介導(dǎo)。
　　第四部分 MAPK信號(hào)通路參與滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對(duì)外周NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用
　　目的解析母-胎界面功能細(xì)胞調(diào)節(jié)外周NK細(xì)胞功能的下游信號(hào)通路
　　方法將分離的pNK分別用JUNK1/2/MAPK信號(hào)通路阻斷劑SP600

10、125，P38/MAPK信號(hào)通路阻斷劑SB202190，ERK/MAPK信號(hào)通路阻斷劑U0126預(yù)處理2小時(shí)，然后加入Tro-NK，DSC-NK，Tro-DSC-NK共培養(yǎng)體系，流式細(xì)胞技術(shù)分析NK細(xì)胞表型、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　結(jié)果 JUNK1/2/MAPK、ERK/MAPK信號(hào)通路抑制原代滋養(yǎng)細(xì)胞，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞表面受體、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用。P38/MAPK不參與原代滋養(yǎng)細(xì)胞，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)作