人蛻膜基質細胞表達的IL-33在誘導早孕母-胎免疫耐受中的作用及其細胞與分子機制.pdf

1、妊娠從免疫學上看類似于器官移植，作為同種移植物的胚胎在母體存活直至分娩，實際上反映母體對胚胎的免疫耐受，母體對胚胎的免疫排斥將導致妊娠失敗。揭示母-胎免疫耐受的確切機制，不僅對生殖免疫，而且對移植免疫、腫瘤免疫、自身免疫疾病都有重要意義。
　　母-胎界面主要包括蛻膜基質細胞、蛻膜免疫細胞及滋養(yǎng)細胞，其中蛻膜基質細胞及蛻膜免疫細胞來源于母體，而滋養(yǎng)細胞則來源于胎兒。多年來人們從不同角度研究母-胎界面發(fā)生的生物學事件，以闡述母-胎免疫

2、調(diào)節(jié)的機制，其中包括母-胎界面各組成細胞的生物學功能調(diào)節(jié)，及母-胎界面Th2型免疫優(yōu)勢的形成。妊娠早期母胎界面的蛻膜被認為是一個免疫特赦組織，妊娠早期大量白細胞在此選擇性聚集，其中最主要的是蛻膜NK細胞，約占淋巴細胞總量的70％-80％，另外還有單核巨噬細胞和T細胞等，這些免疫活性細胞在局部組織微環(huán)境的調(diào)控下能夠獲得特異性的表型和功能，從而決定母-胎界面免疫反應的取向。
　　IL-33是新近發(fā)現(xiàn)的IL-1家族新成員，與受體ST2L

3、及誘餌受體sST2進行相互調(diào)控，參與調(diào)節(jié)Th2型機體免疫，腫瘤進展及轉移等過程。此外，研究報道，IL-33/ST2信號調(diào)控異?？捎绊懽訉m內(nèi)膜容受性進而導致流產(chǎn)，并且其分泌水平與流產(chǎn)及妊娠期高血壓等病理妊娠存在相關性。然而，迄今為止，IL-33在母-胎界面如何發(fā)揮作用仍不清楚。
　　第一部分 IL-33/ST2在正常妊娠早期及復發(fā)性自然流產(chǎn)患者蛻膜基質細胞中的表達
　　目的分析IL-33/ST2在正常妊娠早期和復發(fā)性自然流產(chǎn)患

4、者蛻膜基質細胞中的表達水平。
　　方法收集早孕期正常或不明原因復發(fā)性自然流產(chǎn)的蛻膜組織，采用免疫組織化學方法檢測IL-33/ST2在早孕蛻膜組織中的表達。分離蛻膜基質細胞，采用ELISA、Real-time PCR及Western Blot等技術進一步證實IL-33及ST2在蛻膜基質細胞中的表達，并比較IL-33及ST2表達水平在正常早孕及流產(chǎn)蛻膜基質細胞之間的差別。
　　結果早孕蛻膜組織能檢測到IL-33及ST2的表達。E

5、LISA、Real-time PCR及Western Blot進一步證實了IL-33/ST2在蛻膜基質細胞中的表達，并且在轉錄及翻譯水平，復發(fā)性自然流產(chǎn)的蛻膜基質細胞IL-33/ST2的表達均明顯低于正常妊娠。
　　結論蛻膜組織，尤其是蛻膜基質細胞IL-33及ST2的正常表達對妊娠的維持具有一定的作用。
　　第二部分 IL-33/ST2對蛻膜基質細胞生物學行為的調(diào)控
　　目的解析IL-33對蛻膜基質細胞增殖及侵襲等生物

6、學行為的調(diào)節(jié)。
　　方法收集人早孕期正常的蛻膜組織，應用胰酶消化、密度梯度離心法分離、培養(yǎng)正常人早孕期蛻膜基質細胞。不同濃度的IL-33及sST2作用48h后，分別利用BrdU細胞增殖試劑盒、Transwell實驗及流式細胞術檢測蛻膜基質細胞的增殖能力、侵襲能力及細胞周期。為了驗證IL-33對蛻膜基質細胞生物學行為的調(diào)節(jié)，進一步采用Real-time PCR檢測處理后的蛻膜基質細胞中增殖相關分子(PCNA、 survivin)及侵

7、襲相關分子(titin、MMP2)的表達。
　　結果 BrdU及Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，IL-33以濃度依賴的方式促進蛻膜基質細胞的增殖及侵襲，并且流式細胞術的結果顯示，IL-33處理48h后，蛻膜基質細胞的增殖指數(shù)升高。此外，Real-time PCR的結果顯示IL-33可促進蛻膜基質細胞增殖相關分子(PCNA、 survivin)及侵襲相關分子(titin、MMP2)的表達。
　　結論 IL-33可通過ST2L促進蛻

8、膜基質細胞的增殖及侵襲。
　　第三部分 IL-33調(diào)控蛻膜基質細胞生物學功能的分子機制
　　目的解析IL-33調(diào)控蛻膜基質細胞生物學功能的分子機制。
　　方法分離培養(yǎng)正常人早孕期蛻膜基質細胞，經(jīng)IL-33處理后，利用ELISA及流式細胞術檢測蛻膜基質細胞CCL2及CCR2的表達水平。在培養(yǎng)體系中加入anti-CCL2中和性抗體或CCR2阻滯劑(RS102895)處理后，分別利用BrdU細胞增殖試劑盒、Transwell

9、實驗及流式細胞術檢測蛻膜基質細胞的增殖能力、侵襲能力及細胞周期。用IL-33處理蛻膜基質細胞，采用Western Blot分析信號分子NF-κB、ERK1/2、JNK及P38的磷酸化水平;在此基礎上，用NF-κB抑制劑BAY11-7082、ERK1/2抑制劑U0126和JNK抑制劑SP600125分別預處理蛻膜基質細胞后再用IL-33處理，采用ELISA及流式細胞術檢測蛻膜基質細胞CCL2及CCR2的表達水平。
　　結果經(jīng)IL-3

10、3處理后，蛻膜基質細胞CCL2及CCR2的表達水平增加。拮抗CCL2/CCR2的生物學作用，可下調(diào)IL-33的促增殖及促侵襲作用。WesternBlot結果顯示IL-33可引起NF-κB、ERK1/2及JNK的磷酸化水平升高，NF-κB抑制劑BAY11-7082、ERK1/2抑制劑U0126預處理細胞后，可下調(diào)IL-33引起的CCL2/CCR2升高，然而JNK抑制劑SP600125卻對蛻膜基質細胞表達的CCL2及CCR2無上述下調(diào)作用。

11、
　　結論 IL-33可通過活化NF-κB和ERK1/2信號分子，進而促進蛻膜基質細胞CCL2和CCR2的表達，并間接促進蛻膜基質細胞的增殖及侵襲等生物學行為。
　　第四部分 IL-33參與調(diào)節(jié)蛻膜NK細胞的表型和功能
　　目的解析IL-33對蛻膜NK細胞表型及功能的調(diào)節(jié)作用。
　　方法利用流式細胞術分析蛻膜NK細胞ST2L的表達水平，并比較外周NK細胞與蛻膜NK細胞ST2L的表達水平。用IL-33、sST2或D

12、SCs條件培養(yǎng)液處理蛻膜NK細胞，48h后流式細胞術分析蛻膜NK細胞的表型和細胞因子的表達，細胞毒性檢測試劑盒檢測NK細胞的細胞毒活性。
　　結果流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，蛻膜NK細胞表面表達ST2L，并且ST2L在蛻膜NK的表達水平明顯高于外周NK細胞。IL-33和DSCs條件培養(yǎng)液可顯著上調(diào)蛻膜NK細胞Th2型細胞因子(IL-4、IL-13)、調(diào)節(jié)性細胞因子（IL-10）及促炎性細胞因子IFN-γ的表達水平，并下調(diào)Th1型細胞因子T

13、NF-α的表達。另外，IL-33還可促進NK表面抑制性受體KIR2DL1的表達，并下調(diào)其表面殺傷性受體NKP30和NKG2D的表達。細胞毒實驗結果表明IL-33可降調(diào)節(jié)蛻膜NK細胞的細胞毒活性，與此相一致的是經(jīng)IL-33處理后，NK細胞顆粒酶granzymeA及穿孔素perforin的表達也下降。
　　結論蛻膜基質細胞分泌的IL-33能誘導蛻膜NK細胞的耐受表型及Th2型優(yōu)勢，下調(diào)蛻膜NK細胞的細胞毒活性，從而有利于形成母-胎界面

14、免疫耐受微環(huán)境。
　　第五部分 IL-33調(diào)控蛻膜NK細胞功能和表型的分子機制
　　目的解析IL-33調(diào)節(jié)蛻膜NK細胞功能和表型的下游信號通路
　　方法分離的蛻膜NK細胞經(jīng)IL-33處理后，利用Real-time PCR檢測NK分化發(fā)育相關轉錄因子的表達。用IL-33處理蛻膜NK細胞，采用Western Blot分析信號分子NF-κB、ERK1/2、JNK及P38的磷酸化水平;在此基礎上，用NF-κB抑制劑BAY11-

15、7082、ERK1/2抑制劑U0126和JNK抑制劑SP600125分別預處理蛻膜基質細胞后再用IL-33處理，流式細胞術分析NK細胞表型、細胞內(nèi)細胞因子的表達。
　　結果經(jīng)IL-33處理后，蛻膜NK細胞Nfil3、Id2及Gata3等轉錄因子表達增高。Western Blot結果顯示IL-33可引起NF-κB、ERK1/2及JNK的磷酸化水平升高，NF-κB抑制劑BAY11-7082預處理細胞后，可逆轉IL-33對蛻膜NK細胞表