樹突狀細胞分泌Il-33的機制及其在眼表炎癥中的潛在作用.pdf

1、目的:白細胞介素33(Interleukin33，IL-33)在過敏性炎癥中發(fā)揮重要的作用，鑒于樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)在免疫中的重要作用，我們探索DCs產(chǎn)生IL-33的機制，及其在眼表炎癥中的作用。
　　 方法:在體外，rmGM-CSF(15ng/ml)及rmIL-4(5ng/ml)刺激小鼠骨髓細胞，獲得骨髓來源的DCs，通過流式細胞術(shù)檢測DCs標(biāo)記CD11c的表達水平。通過RT-qPCR技術(shù)，檢測

2、DCs是否表達Toll-like receptor(TLR)1-9 mRNA，進一步通過免疫熒光染色技術(shù)在蛋白水平檢測DCs是否表達TLR4及TLR5。在體外，TLRs1-9配體(1-50μg/ml)刺激DCs，通過RT-qPCR技術(shù)，檢測DCs是否表達IL-33 mRNA，通過ELISA，western blot及免疫熒光染色技術(shù)，進一步在蛋白水平檢測DCs在TLR4及TLR5配體，即LPS及flagellin，刺激下表達IL-33。

3、通過流式細胞術(shù)技術(shù)檢測LPS及flagelin對DCs成熟標(biāo)記CD40、CD80、CD86、MHC classⅡ表達的影響。以flagellin為例，通過TLR5抗體(2μg/ml)，NF-κB抑制劑（10μM）及MyD88基因敲除老鼠來探討DCs分泌IL-33的信號通路。通過rmIL-33，ST2抗體及可溶性ST2蛋白，探索IL-33對DCs的刺激作用及其潛在的自分泌調(diào)節(jié)機制。在體內(nèi)，通過LPS及flagellin建立眼表局部刺激小鼠

4、動物模型，通過花粉建立實驗過敏性結(jié)膜炎小鼠動物模型，檢測DCs是否在體內(nèi)表達IL-33。
　　 結(jié)果:
　　 1.骨髓來源的DCs純度高，大于等于92.9％的細胞表達DCs標(biāo)記CD11c。
　　 2.骨髓來源的DCs在基因水平表達TLR1-9。TLR2，TLR4，TLR7及TLR8表達水平較高，TLR6及TLR9中度表達，而TLR1，TLR3及TLR5表達水平較低。DCs蛋白水平表達TLR4及TLR5。
　

5、　 3.在基因水平，TLR4及TLR5配體，即LPS及flagellin，刺激DCs表達IL-33 mRNA效果最明顯(P＜0.01);而TLR1及TLR3配體，即pam3CSK4及polyI:C，同樣明顯刺激DCs表達IL-33 mRNA(P＜0.05)。IL-33 mRNA在LPS及flagellin刺激DCs8小時后達到高峰;LPS及flagellin的劑量越高，其刺激DCs表達IL-33 mRNA效果越明顯，存在劑量依賴模式。

6、通過ELISA技術(shù)，DCs在LPS及flagellin的刺激下，IL-33蛋白表達明顯升高(P＜0.05)。通過western blot技術(shù)，發(fā)現(xiàn)LPS及flagellin同樣明顯刺激DCs表達IL-33蛋白(P＜0.05)。通過免疫熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在正常對照組中，只有少數(shù)DCs在胞核及胞漿表達IL-33，但是在LPS及flagellin的刺激下，IL-33+細胞明顯增多，IL-33的熒光信號明顯增強。
　　 4.LPS及fl

7、agellin明顯刺激DCs聚集成團，增加CD40+、CD80+、CD86+、MHC classⅡ+細胞，促進CD40(P＜0.01)、CD80(P＜0.05)、CD86(P＜0.01)、MHC classⅡ(P＜0.01)的平均熒光密度，促進DCs成熟。
　　 5.Flagellin明顯刺激DCs表達MyD88(P＜0.01)、NF-κB1(P＜0.01)、NF-κB2(P＜0.01)、Rela(P＜0.05)及IL-33(P

8、＜0.01) mRNA;這些升高的基因明顯被TLR5抗體抑制及NF-κB抑制劑，除了NF-κB抑制劑沒有抑制其上游基因MyD88。Flagellin明顯促進DCs中的NF-κB p65核轉(zhuǎn)移，然而TLR5抗體及NF-κB抑制劑則抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)移。TLR5抗體及NF-κB抑制劑抑制flagellin刺激DCs表達IL-33。
　　 6.Flagellin明顯刺激MyD88+/+DCs表達NF-κB1(P＜0.01)、N

9、F-κB2(P＜0.01)、Rela(P＜0.05)及IL-33(P＜0.01) mRNA;相對于MyD88+/+DCs，這些基因在MyD88-/-DCs表達有所減弱。在flagellin的刺激下，IL-33+DCs數(shù)目在MyD88-/-DCs中明顯比MyD88+/+DCs少。
　　 7.IL-33明顯刺激DCs表達CD40(P＜0.05)，CD80(P＜0.05)，OX40L(P＜0.05)，IL-4(P＜0.001), IL

10、-5(P＜0.01), IL-13(P＜0.01), CCL17(P＜0.05), TNFα(P＜0.05)及IL-1β(P＜0.05) mRNA;IL-33明顯刺激DCs表達CD40(P＜0.05)，CD80(P＜0.05)及OX40L(P＜0.05)蛋白。
　　 8.在眼表局部刺激小鼠動物模型發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)IL-33+/CD11+細胞局部浸潤結(jié)膜，IL-33+/CD11+細胞數(shù)目在LPS及flagellin處理老鼠的頸部淋巴結(jié)明顯

11、增加。
　　 9.在實驗過敏性結(jié)膜炎小鼠動物模型中，同樣發(fā)現(xiàn)IL-33+/CD11+細胞局部浸潤結(jié)膜，IL-33+/CD11+細胞數(shù)目在實驗過敏性結(jié)膜炎小鼠動物的頸部淋巴結(jié)明顯增加。
　　 結(jié)論:
　　 1.病原微生物，如LPS及flagellin，可以刺激DCs通過TLR/NF-κB通路產(chǎn)生IL-33。
　　 2.IL-33可刺激DCs表達炎癥因子。
　　 3.DCs分泌的IL-33可通過潛在的