IL-33在蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠腦組織中的表達(dá)及在炎癥反應(yīng)中的可能作用.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 IL-33在SAH后的表達(dá)、定位及可能作用
　　目的:
　　為檢測(cè)IL-33的在SAH后的表達(dá)和定位情況，并探討IL-33在SAH后可能作用。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:使用成年雄性Sprague-Dawly大鼠，大小約為280-320g按隨機(jī)方法分為空白對(duì)照組和SAH組，其中SAH組又分為SAH模型建立后2h、6h、12h、1d、2d、3d、5d7組。<

2、br>　　2.SAH模型制作和組織的獲取:采用視交叉前池注血模型，在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，選取視交叉前池有積血點(diǎn)的大鼠取顳葉皮質(zhì)為標(biāo)本。
　　3.Western blot analysis:利用凝膠電泳分離總蛋白，以檢測(cè)空白對(duì)照組和蛛網(wǎng)膜下腔出血組各時(shí)間點(diǎn)組IL-33、MyD88總蛋白的表達(dá)情況。利用凝膠電泳分離核蛋白，以檢測(cè)在空白對(duì)照組和蛛網(wǎng)膜下腔出血組各時(shí)間點(diǎn)組NF-κB亞單位P65核蛋白的表達(dá)情況。
　　4.RT-P

3、CR analysis:利用RNA提取試劑盒提取大鼠顳葉皮層腦組織的RNA，并進(jìn)行定量分析;在使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用試劑盒并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以檢測(cè)在空白對(duì)照組和蛛網(wǎng)膜下腔出血組各時(shí)間點(diǎn)大鼠顳葉皮層中IL-33和IL-1β mRNA表達(dá)情況。
　　5.免疫組化染色:制作組織切片，利用免疫組化染色方法檢測(cè)在空白對(duì)照組和蛛網(wǎng)膜下腔出血后1天在大鼠顳葉皮層中IL-33表達(dá)量的變化，及IL-33在細(xì)胞內(nèi)定位的

4、情況。
　　6.免疫熒光雙染:制備組織冰凍切片，利用免疫熒光雙染方法檢測(cè)空白對(duì)照組和蛛網(wǎng)膜下腔出血后1天IL-33在神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)和分布情況。
　　結(jié)果:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)量分析:實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空白組模型制作成功率100％，SAH組模型制作成功率75％;另外SAH組大鼠死亡率、視交叉前池?zé)o積血點(diǎn)比率分別為19.7％和6.8％。
　　2.SAH引起大鼠大腦皮質(zhì)中IL-33蛋白水平升高:I

5、L-33蛋白水平在正常大鼠大腦顳葉皮質(zhì)中呈低表達(dá)狀態(tài)，SAH引起大鼠大腦皮質(zhì)中IL-33蛋白水平升高，在24小時(shí)出現(xiàn)峰點(diǎn)。與空白對(duì)照組相比，SAH后6h、12h、1d、2d、3d IL-33的蛋白水平有顯著升高(p＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.SAH引起大鼠大腦皮質(zhì)中IL-33 mRNA、IL-1β mRNA水平升高，并且兩者mRNA的改變趨勢(shì)具有正相關(guān):與對(duì)照組相比較，SAH后6h、12小時(shí)、1天、2天、3天的IL-3

6、3 mRNA水平顯著升高(p＜0.05)，在24小時(shí)出現(xiàn)峰點(diǎn).;而IL-1β mRNA水平在SAH后1天、3天、5天有顯著性升高(p＜0.05)，也在24小時(shí)出現(xiàn)峰點(diǎn)。行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)兩者變化趨勢(shì)存在正相關(guān)，r=0.50，p＜0.05。
　　4.免疫組化示SAH后IL-33表達(dá)增多，IL-33定位于細(xì)胞核與細(xì)胞漿中:與空白對(duì)照組相比較在SAH后1天IL-33表達(dá)量增多(p＜0.05)，IL-33細(xì)胞陽(yáng)性率分別為34.8％和67.9％

7、;并且SAH后IL-33在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中均有表達(dá)。
　　5.IL-33在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá)，在小膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá):大鼠大腦皮質(zhì)中，在對(duì)照組和SAH后1天組中神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞均有IL-33的表達(dá)，并且SAH引起IL-33表達(dá)量的升高(p＜0.05)。神經(jīng)元中SAH組與對(duì)照組IL-33細(xì)胞陽(yáng)性率分別為68.9％、46.4％;星形膠質(zhì)細(xì)胞中比率分別為:26.7％、14.1％。小膠質(zhì)細(xì)胞中無(wú)IL-33的表達(dá)。
　　6

8、.SAH引起大鼠大腦皮質(zhì)中總蛋白MyD88和核蛋白NF-κB p65蛋白水平升高，并且兩者蛋白含量變化趨勢(shì)與IL-33蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)均具有正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、SAH引起IL-33表達(dá)的升高;
　　2、IL-33定位在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞漿中;
　　3、SAH后IL-33與IL-1β mRNA有正相關(guān)，IL-33與MyD88、NF-κBp65蛋白變化有正相關(guān)。
　　4、IL-33

9、有可能通過(guò)IL-33→MyD88→ NF-κB p65通路參與SAH后的炎癥反應(yīng)過(guò)程。
　　第二部分 外源性IL-33在SAH后作用和可能作用機(jī)制
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)為檢測(cè)IL-33通過(guò)IL-33→MyD88→NF-κB途徑參與蛛網(wǎng)膜下腔出血后的炎癥反應(yīng)的可能性，及IL-33對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血預(yù)后的影響。
　　方法:
　　1.分組實(shí)及給藥:使用成年雄性Sprague-Dawly大鼠，大小約為280-3

10、20g;按隨機(jī)方法分為蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH)、蛛網(wǎng)膜下腔出血+生理鹽水組(SAH+Vehicle)、蛛網(wǎng)膜下腔出血+低劑量外源性IL-33組(SAH+LOW IL-33)、蛛網(wǎng)膜下腔出血+高劑量外源性IL-33組(SAH+HIGH IL-33)。SAH+Vehicle組在SAH模型制作后半小時(shí)往視交叉前池注射無(wú)菌生理鹽水10ul; SAH+LOWIL-33組在SAH模型制作后半小時(shí)往視交叉前池注射外源性IL-3330ng（溶于10u

11、l生理鹽水中）;SAH+HIGH IL-33組在SAH模型制作后半小時(shí)往視交叉前池注射外源性IL-33300ng（溶于10ul生理鹽水中）;SAH組模型制作后不再往視交叉前池注射任何液體。
　　2.SAH模型制作和組織的獲取:采用視交叉前池注血模型，在模型制作后1天選取視交叉前池有積血點(diǎn)的大鼠取顳葉腦皮質(zhì)為標(biāo)本。
　　3.Western blot analysis:用于檢測(cè)各組在蛛網(wǎng)膜下腔出血后1天MyD88總蛋白和NF-κ

12、B p65核蛋白的改變情況。
　　4.RT-PCR analysis:用于檢測(cè)各組在蛛網(wǎng)膜下腔出血后1天MyD88和IL-1βmRNA的改變情況。
　　5.神經(jīng)功能評(píng)分:在各組造模后24小時(shí)，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，本實(shí)驗(yàn)使用Garcia評(píng)分系統(tǒng)，該評(píng)分最高評(píng)18分，最低3分;用于評(píng)估各組大鼠SAH的嚴(yán)重程度。
　　6.腦水腫測(cè)定:在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型制作后1天處死大鼠，測(cè)定腦水腫，計(jì)算方法為([濕重-干重]/濕重]×100

13、％);用于評(píng)估大鼠腦水腫嚴(yán)重程度。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（(x)+SEM）表示，多組均數(shù)比較先采用單因素方差分析，接采用Dunnett-t檢驗(yàn)，均以p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)量分析:本實(shí)驗(yàn)原計(jì)劃在使用48只大鼠，實(shí)際使用61只大鼠，在SAH組有3只大鼠死亡或者造模失敗，模型制作成功率為80％;在SAH+Vehicl

14、e組有4只大鼠死亡或者造模失敗，模型制作成功率為75％;在SAH+LOW IL-33組有4只大鼠死亡或者造模失敗，模型制作成功率為75％;在SAH+HIGH IL-33組有2只大鼠死亡或者造模失敗，模型制作成功率為85％.
　　2.SAH后外源性IL-33引起大鼠大腦皮質(zhì)中MyD88總蛋白表達(dá)量的升高:與SAH組相比SAH+Vehicle組MyD88總蛋白水平的改變并無(wú)顯著性差異;與SAH組相比，SAH+LOW IL-33組與SA

15、H+HIGH IL-33組MyD88總蛋白水平有顯著升高(p＜0.05)。
　　3.SAH后外源性IL-33引起大鼠大腦皮質(zhì)中NF-κB p65核蛋白表達(dá)量的升高:與SAH組相比較SAH+HIGH IL-33組NF-κB核蛋白有顯著性升高(p＜0.05)。與SAH組相比SAH+Vehicle組與SAH+LOW IL-33組NF-κB核蛋白含量的改變并無(wú)顯著性差異。
　　4.SAH后外源性IL-33引起大鼠大腦皮質(zhì)中MyD88

16、、IL-1βmRNA水平提高:與SAH組相比SAH+LOW IL-33組和SAH+HIGH IL-33組MyD88 mRNA水平有顯著性提高(p＜0.05)， SAH+Vehicle組無(wú)顯著性差異;與SAH組相比SAH+LOW IL-33組和SAH+HIGH IL-33組IL-1β mRNA水平有顯著性提高(p＜0.05)，SAH+Vehicle組無(wú)顯著性差異。
　　5.SAH后外源性IL-33引起大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低:與SAH組

17、相比SAH+HIGH IL-33組神經(jīng)功能評(píng)分有顯著性降低(p＜0.05)，SAH+Vehicle組、SAH+LOW IL-33組無(wú)顯著性差異。
　　6.SAH后外源性IL-33加重大鼠腦水腫:與SAH組相比SAH+LOW IL-33組和SAH+HIGH IL-33組腦水腫顯著性加重（p＜0.05）。與SAH組相比SAH+Vehicle組腦水腫無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1.SAH后外源性IL-33可引起MyD88