脾臟樹突狀細(xì)胞在多器官功能障礙綜合征炎癥反應(yīng)機制中作用的研究.pdf

1、目的： 1．研究MODS小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞(DC)病變對多種炎癥因子變化的影響及其分子機制。 2．探討膽堿能抗炎通路對MODS早期DC及細(xì)胞免疫功能的影響與調(diào)節(jié)作用。 3．研究Flt3L對MODS免疫失衡的可能保護效應(yīng)。 方法：腹腔注射酵母多糖復(fù)制小鼠MODS模型，實驗分組： (1)正常對照組(n=30)； (2)MODS組(n=150)又分為6小時、24小時、48小時、6日和10～12日

2、組； (3)卡巴膽堿治療組(n=30)：致傷前小鼠經(jīng)胃給予卡巴膽堿(3μg/kg，三次)； (4)Flt3L治療組(n=30)：在MODS病程緩解期腹腔注射Flt3L(5μg/kg/日，連續(xù)7天)。分別在設(shè)定的時間點采取血和肺、肝、腎、脾臟等組織標(biāo)本。采用MiniMACS免疫磁性分離系統(tǒng)分離純化脾臟DC，運用流式細(xì)胞技術(shù)檢測脾臟DC免疫表型、外周血T細(xì)胞亞群和外周血單個核細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測DC孵育

3、上清及組織勻漿液的細(xì)胞因子，用熒光定量PCR檢測DC中NF-κBp65mRNA表達水平。免疫組化檢測脾臟中CD86、IL-1β、IL-10和HMGB1表達。光、電鏡觀察各組臟器結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果： (1)IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)量在傷后6、24小時組明顯升高，48小時至10～12日組降至正常水平。HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)量在傷后6小時組開始升高，于48小時組達峰值；6日組降至正常，10～12日組再次明顯升高；IL-10陽性細(xì)胞數(shù)量

4、在傷后48小時組開始升高，10～12日組達峰值； (2)脾臟DC的含量在6和24小時組明顯增加，48小時組開始下降，6日組接近正常組，10～12日DC數(shù)量再次明顯增生；傷后6和124小時組DC表面分子MHC-Ⅱ和CD86的表達明顯增高，48小時和6日組MHC-Ⅱ和CD86下降至正常水平，10～12日組MHC-Ⅱ和CD86的表達明顯降低。DC孵育上清中IL-12p70含量在傷后6、24小時組明顯增加，48小時和6日組恢復(fù)至正常水平

5、，10～12日組IL-12p70含量明顯降低。傷后6、24小時組DC細(xì)胞中NF-κB p65mRNA的表達顯著增加，10～12日組NF-κBp65mRNA表達明顯下降。 (3)傷后6～48小時組，實驗鼠臟器功能指標(biāo)中ALT升高，其余改變不明顯。外周血中單核細(xì)胞對MHC-Ⅱ分子表達及CD4<'+>T細(xì)胞數(shù)均減少，CD4/CD8比值下降。病理改變主要為部分臟器實質(zhì)細(xì)胞變性伴間質(zhì)淤血、水腫；6日組，實驗鼠功能與形態(tài)均有好轉(zhuǎn)。外周血單核

6、細(xì)胞MHC-Ⅱ分子表達及CD4<'+>T細(xì)胞數(shù)均有增加，CD4/CD8比值回升。10～12日組，各項生化指標(biāo)均顯著上升，外周血單個核細(xì)胞MHC-Ⅱ分子表達降至最低點，CD4<'+>T細(xì)胞也明顯減少，CD4/CD8比值明顯下降。主要臟器實質(zhì)細(xì)胞多呈變性與灶狀壞死改變。 (4)卡巴膽堿治療組脾臟DC對MHC-Ⅱ表達下降，脾臟中IL-12 p70水平下降；脾臟中IL-1β和HMGB1陽性細(xì)胞明顯下降；臟器功能與形態(tài)改變均較輕微。

7、 (5)體外實驗證實1μmol/ml、10μmol/ml和100μmol.ml濃度的卡巴膽堿均能夠降低LPS刺激的培養(yǎng)DC對MHC-Ⅱ的表達及其IL-12 p70的分泌。其中卡巴膽堿濃度在100μmol/ml時對DC表面MHC-Ⅱ表達和DC分泌IL-12p70的抑制作用最明顯。α-銀環(huán)蛇毒素可明顯阻斷卡巴膽堿的上述效應(yīng)。 (6)Flt3L治療組脾臟DC對MHC-Ⅱ表達明顯增加，脾組織中IL-12p70水平明顯升高，外周血單個核

8、細(xì)胞MHC-Ⅱ分子表達增加，CD4<'+>T細(xì)胞數(shù)也明顯增多，CD4/CD8比值明顯上調(diào)。脾臟中IL-10陽性細(xì)胞數(shù)下降；肝、腎功能指標(biāo)接近正常組，肺、肝、腎、心和脾臟病理改變較MODS12日組明顯減輕。 結(jié)論： 1．脾臟樹突狀細(xì)胞的活性變化與多種炎癥因子表達的變化在MODS病程中具有密切的相關(guān)性和規(guī)律性。 2．樹突狀細(xì)胞對MODS炎癥反應(yīng)的方向具有影響和調(diào)節(jié)作用。NF-κB-IL-12途徑是樹突狀細(xì)胞免疫．炎癥