腸缺血再灌注導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)及多器官功能障礙綜合征的機(jī)理研究.pdf

1、研究背景和目的： 腸缺血再灌注是發(fā)生多器官功能障礙綜合征的重要病理生理過程。全身炎癥反應(yīng)是ⅡR后MODS發(fā)生的重要發(fā)病機(jī)理，早期干預(yù)炎癥反應(yīng)，積極防治MODS，是降低危重病患者病死率的重要手段。 全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的發(fā)生取決于機(jī)體的免疫系統(tǒng)。傳統(tǒng)上免疫系統(tǒng)分為天然免疫和獲得性免疫。我們課題組前期工作表明獼猴ⅡR后并發(fā)SIRS及MODS的發(fā)病過程中，腸粘膜TLRs-NF-кB-炎癥介質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路全面激活，但I(xiàn)gA、SC、

2、SIgA均顯著減少，表現(xiàn)為腸粘膜過強(qiáng)天然免疫與降低的獲得性體液免疫共同存在。IFN-γ是免疫炎癥反應(yīng)的一種重要調(diào)控因子，對(duì)天然免疫和獲得性免疫均有調(diào)控作用，但I(xiàn)FN-γ是否參與ⅡR后腸粘膜免疫反應(yīng)及SIRS的形成?如果參與，是通過何種機(jī)制?細(xì)胞因子常與其它激素，神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)共同組成細(xì)胞間信號(hào)分子系統(tǒng)，如果IFN-γ參與了腸黏膜免疫活動(dòng)，生長抑素是否影響IFN-γ的產(chǎn)生?通過這方面的研究，以期增進(jìn)我們對(duì)ⅡR后腸黏膜免疫的認(rèn)識(shí)，并為防治

3、SIRS、MODS提供新的思路。 急性重癥胰腺炎是導(dǎo)致ⅡR的常見病因，在SAP-ⅡR-MODS的發(fā)生中，ⅡR反過來對(duì)胰腺組織病理及功能又有何影響?自SST用于治療SAP以來，有效降低了MODS發(fā)病率。SST的這些作用究竟僅僅是因?yàn)橐种屏艘让阜置?，還是可以避免ⅡR后SIRS對(duì)胰腺的再次打擊?這方面的研究將更新臨床防治MODS或SAP的思路，并增加我們對(duì)SST在抗炎藥理方面的認(rèn)識(shí)。 傳統(tǒng)認(rèn)為，B細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫在腸粘膜免

4、疫中具有重要的作用。我們研究小組前期的實(shí)驗(yàn)表明ⅡR后，大鼠腸淋巴細(xì)胞歸巢增加，獼猴PP內(nèi)B細(xì)胞明顯增多，但是腸粘膜獲得性體液免疫效應(yīng)卻表現(xiàn)為slgA減少。新近研究表明，B淋巴細(xì)胞具有獲得性免疫及天然免疫的雙重功能。那么ⅡR時(shí)PP內(nèi)大量集聚的B細(xì)胞是否參與腸黏膜增強(qiáng)天然免疫的形成?如果有，是哪一類或哪一發(fā)育階段的B細(xì)胞?參與天然免疫的B細(xì)胞是否包括具有免疫記憶的B淋巴母細(xì)胞?這些研究能增進(jìn)我們對(duì)臨床防治SIRS及MODS分子靶點(diǎn)的新認(rèn)識(shí)。

5、 方法： 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：全部實(shí)驗(yàn)所用健康成年獼猴來自成都野生動(dòng)物世界，雌雄不限，體重6.9±1.7Kg。獼猴進(jìn)出成都野生動(dòng)物世界獼猴喂養(yǎng)區(qū)時(shí)均檢疫合格。 2．實(shí)驗(yàn)分組：15只健康成年獼猴隨機(jī)分為正常、ⅡR、ⅡR+SST三組，每組5只動(dòng)物。腸缺血再灌注手術(shù)：肌注復(fù)方二甲苯胺噻嗪麻醉動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)過程中用安定靜注0.16±0.09mg/kg/h維持昏睡狀態(tài)。無菌鋪巾，沿腹正中切開，分離腸系膜上動(dòng)脈后予以夾閉， 60 mi

6、n后松夾進(jìn)行再灌注，恢復(fù)腸系膜上動(dòng)脈血流。再灌注后1h，靜脈輸入0.9％鹽水，0.1～0.2ml/kg/min，24h內(nèi)補(bǔ)入葡萄糖20g。 3．預(yù)防使用SST：在夾閉腸系膜上動(dòng)脈前，從靜脈滴注生長抑素，5μg/kg/h，持續(xù)至再灌注后24h。 4．HE染色法觀察回腸、胰腺組織病理損傷程度。 5．放射免疫分析檢測外周血SST的含量。 6．ELISA檢測腸上皮細(xì)胞、腸淋巴細(xì)胞、腸淋巴細(xì)胞孵育上清液、回腸組織勻

7、漿、外周血清、門靜脈血清中IFN-γ的水平。 7．ELISA檢測外周血清及回腸組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。 8．酶比色法檢測血清淀粉酶及脂肪酶。 9．免疫組化檢測IFN-γ、CD4、CD8、CD57、CD20、CD5、PAX-5、漿細(xì)胞、TLR4、TLR2、NF-кB、integrin α4β7的分布，圖像分析軟件測定陽性面積及IOD值。 10．門靜脈血培養(yǎng)。 11．培養(yǎng)人B淋

8、巴母細(xì)胞株hmy2.cir，細(xì)胞干預(yù)組加入LPS(10μg/ml)，另一組為無干預(yù)的空白對(duì)照組，37℃，5％CO<,2>孵育。 12．ELISA檢測干預(yù)24小時(shí)后培養(yǎng)上清液中IL-6及干預(yù)72小時(shí)后培養(yǎng)上清液中IgM的水平。 13．免疫熒光檢測hmy2.cir細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)。 14．MTT檢測LPS干預(yù)hmy2.cir細(xì)胞株后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的增殖情況. 結(jié)果： 1．ⅡR后

9、回腸粘膜上皮細(xì)胞、門靜脈血內(nèi)IFN-γ水平較正常組顯著增加，而腸淋巴細(xì)胞及其上清液的IFN-±水平較正常組明顯降低； 2．預(yù)防性給予SST后，與ⅡR組比較，回腸上皮細(xì)胞及門靜脈血內(nèi)IFN-γ的水平顯著下降，腸淋巴細(xì)胞及其上清液的IFN-γ水平無明顯變化； 3．組織勻漿及外周血的IFN-γ水平在三組間無明顯差別。CD4<'+>細(xì)胞、CD57<'+>細(xì)胞分布與IFN-γ無關(guān)，CD8<'+>細(xì)胞分布與IFN-γ變化趨勢相反。

10、 4．ⅡR后小腸黏膜PP數(shù)量增加、增大。 5．正常組獼猴腸黏膜PP內(nèi)的B細(xì)胞均為PAX-5<'+>CD20<'+>CD5<'->，系B-2細(xì)胞，黏膜固有層有散在漿細(xì)胞。ⅡR后PP內(nèi)PAX-5<'+>細(xì)胞顯著增加，但其中CD20表達(dá)未見增多，CD5<'->表達(dá)，出現(xiàn)PAX-5<'+>CD20<'->CD5<'->的祖B細(xì)胞，黏膜固有層內(nèi)漿細(xì)胞顯著減少。 6．正常時(shí)，PP中TLR2、TLR4、NF-кB及IFN-γ表達(dá)

11、均較弱，ⅡR時(shí)PP內(nèi)四種分子表達(dá)均明顯增強(qiáng)。 7．正常PP內(nèi)有散在α4β7表達(dá)，ⅡR組明顯減少。 8．ⅡR后，獼猴外周血及回腸黏膜組織中炎癥介質(zhì)IL-1β，與正常組IL-1β、IL-6、TNF-α比較，均顯著增加。SST治療后，外周血中IL-1β(40.0±9.9he/ml)、IL-6(244.4±70.0 ne/ml)、TNF-α(19.2±10.1 ng/ml)水平明顯下降，與ⅡR組相比有顯著性差異(p<0.05)。

12、 9．正常組5只動(dòng)物的門靜脈血培養(yǎng)均為陰性；ⅡR組所有獼猴血培養(yǎng)均有細(xì)菌生長，陽性率為100％，而且引起菌血癥的細(xì)菌均為大腸桿菌。 10．LPS干預(yù)72小時(shí)后，hmy2.cir細(xì)胞上清液中IgM水平為0.528±0.002 ng/ug總蛋白，與空白對(duì)照組 相比顯著減少。 11．LPS干預(yù)72小時(shí)后，與對(duì)照組相比，hrny2.cir細(xì)胞TLR4的IOD(1201.3±913.4 vs 5078.2±2483.2)及

13、TLR2的IOD較對(duì)照組顯著減少。 12．LPS干預(yù)24小時(shí)后，hmy2.cir細(xì)胞上清液中IL-6水平(0.528±0.002 pg/ug總蛋白)與空白對(duì)照組(0.406±0.218pg/ug總蛋白)相比顯著減少(p<0.05)。 13．LPS干預(yù)24小時(shí)后，hmy2.cir細(xì)胞增殖水平(0.389±0.061)較空白對(duì)照組(0.727±0.245)為低，72小時(shí)后細(xì)胞增殖水平(0.562±0.219)較對(duì)照(0.17

14、3±0.079)顯著增加(p<0.05)。 14．ⅡR后，所測胰淀粉酶(2492.0±2102.8 IU/L vs 385.4±136.1 IU/L)及脂肪酶(1278.0±1446.3 IU/L VS 25.8±13.0IU/L)在血中水平較正常組均顯著升高(p<0.05)。預(yù)防性使用SST，既使發(fā)生ⅡR，血胰淀粉酶(567.0±338.0IU/L)及血脂肪酶(77.2±77.9IU/L)明顯回落。 15．放射免疫分析

15、結(jié)果表明，ⅡR后外周血SST(62.17±13.56 pg/ml)較正常對(duì)照(160.61±33.84 pg/ml)明顯下降(p<0.05)，靜脈補(bǔ)充SST后，循環(huán)SST水平(156.32±30.25 pg/ml)顯著回升(p<0.05)。 16．ⅡR時(shí)可見胰腺組織病理損傷。預(yù)防性使用SST后，胰腺病理組織學(xué)較ⅡR時(shí)明顯減輕，組織學(xué)評(píng)分從+++降到++。 結(jié)論： 1．ⅡR后，來源于上皮細(xì)胞及早期祖B細(xì)胞大量產(chǎn)生I

16、FN-γ，后果是通過腸、黏膜、肺泡肥大細(xì)胞上的FcεRIα活化肥大細(xì)胞，引起強(qiáng)烈的天然免疫反應(yīng)。換言之，IFN-γ將TLR-NF-кB與肥大細(xì)胞兩個(gè)天然免疫反應(yīng)通路聯(lián)系在一起，構(gòu)成了復(fù)雜、高效的天然免疫網(wǎng)絡(luò)。 2．ⅡR后祖B細(xì)胞參與腸黏膜天然免疫反應(yīng)，在腸黏膜屏障嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)常伴發(fā)LPS血癥，這使得LPS可在循環(huán)甚至骨髓中通過祖B細(xì)胞的TLR介導(dǎo)使祖B細(xì)胞迅速卷入天然免疫，在循環(huán)中產(chǎn)生大量IL-1B、IL-6、TNF-α，這應(yīng)是S

17、IRS發(fā)生的重要原因之一。 3．ⅡR后腸黏膜PP內(nèi)PAX-5<'+>CD20<'+>CD5<'->、具有免疫記憶的B淋巴母細(xì)胞并未在強(qiáng)烈、快速反應(yīng)的天然免疫中發(fā)揮明顯作用。 4．整個(gè)B淋巴細(xì)胞群具有天然免疫及獲得性免疫的雙重功能。在不同發(fā)育階段的B淋巴細(xì)胞僅分別發(fā)揮其中某一項(xiàng)功能。代表早期發(fā)育階段的祖B淋巴細(xì)胞高表達(dá)TLRs，且能被LPS激活，經(jīng)TLR-NF-кB-促炎因子途徑發(fā)揮快速、強(qiáng)烈的天然免疫功能；成熟B細(xì)胞具有