PPARγ蛋白的體液表達及其對母胎界面滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質(zhì)細胞生物學(xué)功能的影響.pdf

1、第一部分 PPARγ蛋白在GDM孕婦及正常妊娠孕婦外周血、新生兒臍血及羊水中的表達
　　目的:通過檢測GDM孕婦及正常妊娠孕婦外周血、新生兒臍血及羊水中PPARγ蛋白的表達，了解PPARγ是否在人體液組織內(nèi)表達，并比較其在GDM孕婦與正常妊娠孕婦的體外表達有無差異。
　　方法:選取在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科2012年10-11月足月妊娠行選擇性剖宮產(chǎn)的GDM孕婦和正常妊娠孕婦各30例，孕38-41周期間選擇性剖宮產(chǎn)手術(shù)時采

2、集孕婦外周血、新生兒臍血及羊水。ELLSA方法檢測GDM孕婦及正常妊娠孕婦外周血、新生兒臍血及羊水中PPARγ蛋白的表達。
　　結(jié)果:GDM足月妊娠孕婦血漿中PPARγ蛋白濃度(0.201 ng/ml)高于正常足月孕婦血漿中PPARγ蛋白濃度（0.153ng/ml），其差異有顯著性(P＜0.001)。GDM足月妊娠新生兒臍帶血漿及羊水中PPARγ蛋白濃度與正常足月孕婦新生兒臍帶血漿及羊水中PPARγ蛋白濃度，無統(tǒng)計學(xué)差異。

3、　　結(jié)論:本研究首次發(fā)現(xiàn)了細胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ蛋白在細胞外液即人體液組織中的表達，我們推測PPARγ可能通過一定的機制由細胞內(nèi)釋放至細胞外，并且為了維持胎兒體內(nèi)及羊水中PPARγ蛋白的穩(wěn)態(tài)，GDM孕婦外周血的PPARγ蛋白反應(yīng)性的增高，但PPARγ蛋白影響母胎界面細胞功能需要進一步研究。
　　第二部分 PPARγ蛋白在GDM孕婦胎盤、羊膜、絨毛膜的定位
　　目的:通過分析GDM孕婦胎盤、羊膜、絨毛膜上PPARγ蛋白的

4、定位表達，了解PPARγ蛋白在母胎界面可能的功能。
　　方法:選取在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科2012年10-11月足月妊娠行選擇性剖宮產(chǎn)的GDM孕婦的胎盤、羊膜、絨毛膜組織各5例。免疫組化方法檢測PPARγ蛋白的表達。
　　結(jié)果:在GDM孕婦的胎盤組織中，PPARγ陽性表達，主要表達在合體滋養(yǎng)細胞核，細胞滋養(yǎng)細胞未見明顯表達。在GDM孕婦羊膜組織中，PPARγ陽性表達，表達主要位于羊膜上皮層中的單層立方上皮細胞的細胞核內(nèi)、

5、成纖維細胞層中的成纖維細胞細胞核內(nèi)及無定形基質(zhì)內(nèi)。在GDM孕婦絨毛膜組織中，PPARγ陽性表達，表達主要位于網(wǎng)狀層的細胞的細胞膜上及成纖維細胞細胞核內(nèi)。
　　結(jié)論:在胎盤層面，PPARγ蛋白定位于胎盤的合體滋養(yǎng)細胞核、細胞質(zhì)，可見PPARγ蛋白不僅定位于細胞核內(nèi)，有可能通過細胞損傷分泌到細胞質(zhì)、細胞外的可能，進一步支持了臨床實驗過程中臍血血漿、羊水中檢測到PPARγ蛋白的表達。在羊膜、絨毛膜層面，PPARγ蛋白定位于羊膜上皮細胞核

6、、無定型基質(zhì)內(nèi)及絨毛膜網(wǎng)狀層細胞的細胞膜上，進一步支持了胎膜的分泌功能，有可能PPARγ蛋白通過胎膜的分泌功能分泌進入羊水。由此可見PPARγ蛋白可能通過內(nèi)分泌分泌到外周循環(huán)，進而發(fā)揮作用。
　　第三部分 PPARγ蛋白對細胞糖、脂代謝能力的影響
　　目的:建立滋養(yǎng)細胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的體外誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系，模擬母胎界面細胞間的相互作用，通過改變PPARγ蛋白在共培養(yǎng)體系中的濃度，分析滋養(yǎng)細胞合體化相關(guān)分子、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細

7、胞容受性相關(guān)分子以及兩種細胞糖、脂代謝能力的改變，進一步了解PPARγ是否發(fā)揮母胎細胞交互作用的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)作用是否影響細胞的糖、脂代謝功能的改變。
　　方法:采用人絨癌滋養(yǎng)細胞株（BeWo細胞）及子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞（ESC細胞）建立細胞共培養(yǎng)體系，在共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中加入純化的PPARγ蛋白，改變細胞培養(yǎng)微環(huán)境中游離PPARγ蛋白的濃度，分別設(shè)立PPARγ蛋白濃度為0.25ng/μL、5 ng/μL、10 ng/μL。RT-PCR方

8、法檢測細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運體1(GLUT1)、硬脂酰CoA去飽和酶(SCD)的表達，檢測滋養(yǎng)細胞合體化分子syncytin的表達，檢測子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞容受性相關(guān)分子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達。油紅O染色法觀察共培養(yǎng)體系中BeWo細胞和ESC細胞對脂質(zhì)的儲存能力改變。
　　結(jié)果:1）BeWo細胞GLUT1 mRNA、SCD mRNA的表達:單獨培養(yǎng)體系中，在各濃度PPARγ作用下，BeWo細胞表達Glut1 mRNA、SCD mR

9、NA相對表達率均無差異性。在共培養(yǎng)體系中，在PPARγ蛋白濃度為10ng/ml、5ng/ml時，BeWo細胞表達Glut1 mRNA相對表達率相對空白對照組有顯著性增高(P＜0.05)，SCD mRNA相對表達率隨著PPARγ蛋白增加有一定增高趨勢，但是無統(tǒng)計學(xué)差異。共培養(yǎng)體系相對單獨培養(yǎng)體系BeWo細胞Glut1 mRNA、SCD mRNA相對表達率數(shù)值上有一定升高，僅在PPARγ蛋白濃度為10ng/m，SCD mRNA相對表達率的升

10、高有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2) ESC細胞中GLUT1 mRNA、 SCD mRNA的表達:單獨培養(yǎng)體系、共培養(yǎng)體系中ESC細胞表達Glut1 mRNA、SCD mRNA無差異性。
　　3) BeWo細胞內(nèi)脂質(zhì)儲存能力:在共培養(yǎng)體系中，隨著蛋白濃度的調(diào)高，油紅O染色發(fā)現(xiàn)，BeWo細胞質(zhì)內(nèi)脂肪的含量增多，PPARγ蛋白的濃度為10ng/ml的時候，BeWo細胞質(zhì)內(nèi)脂肪的含量明顯增多。
　　4) ESC細胞內(nèi)脂

11、質(zhì)儲存能力:在共培養(yǎng)體系中，隨著蛋白濃度的調(diào)高，油紅O染色發(fā)現(xiàn)，ESC細胞質(zhì)內(nèi)脂肪的含量增多，PPARγ蛋白的濃度為10ng/ml的時候，ESC細胞質(zhì)內(nèi)脂肪的含量明顯增多。
　　5) BeWo細胞合體化相關(guān)因子的表達:單獨培養(yǎng)體系中，隨著蛋白濃度的調(diào)高，RT-PCR檢測BeWo細胞表達Syncytin mRNA有一定增加趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。共培養(yǎng)體系中，Syncytin mRNA的相對表達率隨著蛋白濃度的調(diào)高，沒有趨向性。6)

12、ESC細胞容受性相關(guān)因子的表達:單獨培養(yǎng)體系、共培養(yǎng)體系中ESC細胞表達VEGF mRNA無差異性。
　　結(jié)論:在BeWo細胞和ESC細胞糖脂轉(zhuǎn)運代謝的研究發(fā)現(xiàn)，僅在共培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)PPARγ蛋白濃度為5ng/ml、10ng/ml時，BeWo細胞表達Glut1 mRNA相對表達率相對空白對照組有顯著性增高，且共培養(yǎng)體系相對單獨培養(yǎng)體系中Glut1mRNA、SCD mRNA相對表達率有升高趨勢，PPARγ蛋白濃度為10ng/ml時

13、，SCDmRNA相對表達率的升高有統(tǒng)計學(xué)差異，有可能PPARγ蛋白依靠BeWo細胞和ESC細胞之間的相互影響發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞糖代謝的作用。油紅O染色發(fā)現(xiàn)BeWo細胞和ESC細胞內(nèi)脂滴的累積隨著PPARγ蛋白的濃度的增高有一定增加，隨著PPARγ蛋白的濃度的增高，BeWo細胞和ESC細胞對于脂肪的儲存能力明顯提高，表明PPARγ蛋白可以促進細胞改善細胞脂肪代謝，有可能可以改善外周循環(huán)中高血脂的情況。
　　BeWo細胞合體化因子syncy

14、tin的分泌在單獨培養(yǎng)體系梯形增加，且光鏡下BeWo細胞合體化增加，表明PPARγ蛋白作用于BeWo細胞，一定程度上促進了滋養(yǎng)細胞的合體化，但其量的積累尚未達到質(zhì)的變化，因此雖未見統(tǒng)計學(xué)差異，但仍表明在PPARγ蛋白作用下BeWo細胞的合體化仍處于較好的狀態(tài)，未出現(xiàn)滋養(yǎng)細胞融合異常。而在共培養(yǎng)體系隨著PPARγ蛋白濃度的增高，BeWo細胞表達Syncytin mRNA水平無差異，表明有可能在ESC細胞的影響，BeWo細胞融合異常。ESC

15、細胞的VEGF mRNA表達率，未隨著PPARγ蛋白濃度的增高而發(fā)生變化，說明細胞外液的PPARγ可能對子宮內(nèi)膜細胞的容受性無明顯影響。
　　綜上所述，可見PPARγ蛋白促進共培養(yǎng)體系中滋養(yǎng)細胞糖轉(zhuǎn)運蛋白GULT1和脂代謝蛋白SCD的表達，并促進共培養(yǎng)體系兩種細胞對脂質(zhì)的攝取，而對兩種細胞合體化分子Syncytin和容受性分子VEGF無明顯影響，推測細胞外液的PPARγ蛋白可能影響了母胎界面細胞的糖脂轉(zhuǎn)運功能，可以促進細胞對脂質(zhì)的