妊娠早期母胎界面IDO表達(dá)對(duì)蛻膜NK細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的影響.pdf

1、妊娠的成功恰恰依賴(lài)于母胎免疫耐受狀態(tài)，但其中的機(jī)制至今尚不十分清楚。妊娠早期母胎界面成分及其構(gòu)成的特殊的免疫微環(huán)境對(duì)母胎免疫耐受的維持至關(guān)重要。位于母胎界面的蛻膜被認(rèn)為是一個(gè)免疫特赦組織，妊娠早期大量白細(xì)胞在此選擇性聚集，其中最主要的是蛻膜NK(decidual natural killer,dNK)細(xì)胞，約占淋巴細(xì)胞總量的70-80％，另外還有樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)、單核巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞。這些免疫活性細(xì)胞

2、在局部組織微環(huán)境的調(diào)控下能夠獲得特異性的表型和功能，從而決定局部免疫反應(yīng)的取向-免疫應(yīng)答或免疫耐受形成。 本研究分為三部分 第一部分:主要探討妊娠早期母胎界面IDO表達(dá)情況以及與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的關(guān)系； 第二部分:探討IDO是否調(diào)控dNK細(xì)胞表面殺傷活性受體表達(dá)和殺傷活性等功能; 第三部分:是利用新近發(fā)現(xiàn)的BDCA標(biāo)志來(lái)檢測(cè)早孕期蛻膜組織中DCs亞群及其表型特點(diǎn)，并進(jìn)一步分析DCs亞群的數(shù)量隨孕周變化的特點(diǎn)

3、。本研究有助于深入理解母胎免疫耐受調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為母胎免疫失衡相關(guān)妊娠并發(fā)癥的診治提供新的策略。 第一部分:妊娠早期母胎界面及滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo中IDO表達(dá)與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的關(guān)系 目的：探討人妊娠早期母胎界面及人絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo中IDO的表達(dá)與RSA的關(guān)系。 方法：(1)免疫組化法檢測(cè)正常妊娠早期和RSA患者絨毛和蛻膜組織中IDO蛋白質(zhì)表達(dá)；定量RT-PCR法檢測(cè)兩組絨毛和

4、蛻膜組織中IDO mRNA的表達(dá)。(2)絨毛組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人妊娠早期絨毛組織，高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)培養(yǎng)上清中有無(wú)犬尿氨酸，并分析IFN-γ對(duì)IDO功能活性的影響。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HTR-8/SVneo細(xì)胞中IDO蛋白質(zhì)表達(dá)；定量RT-PCR法檢測(cè)IDOmRNA表達(dá)水平；HPLC法檢測(cè)培養(yǎng)上清中有無(wú)犬尿氨酸，并分析IFN-γ對(duì)IDO表達(dá)水平及功能活性的影響。 結(jié)論：絨毛及蛻膜組織IDO正常表達(dá)是維持妊娠所必需；

5、HTR-8/SVneo細(xì)胞表達(dá)有活性的IDO。 第二部分:HTR-8/SVneo細(xì)胞IDO表達(dá)對(duì)dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞表面NKG2D和NKp46表達(dá)及殺傷活性功能的影響 目的：探討HTR-8/SVneo細(xì)胞IDO表達(dá)對(duì)dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞表面活化性受體NKp46和NKG2D表達(dá)及殺傷活性等功能的影響。 方法：(1)體外分離正常孕5-9周蛻膜組織單個(gè)核細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選法純化CD56+dNK細(xì)胞

6、和pNK細(xì)胞。(2)FCM法檢測(cè)分離純化的CD56+dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞的純度和表型。(3)將分離純化的CD56+dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞體外培養(yǎng)48小時(shí)，根據(jù)條件培養(yǎng)基(CM)類(lèi)型將試驗(yàn)分為3組：正常培養(yǎng)基組(陰性培養(yǎng)基對(duì)照組)；HTR-8/SVneo細(xì)胞48 h獲得的條件培養(yǎng)基組(IDO CM組)；HTR-8/SVneo細(xì)胞+色氨酸阻斷劑1-MT 48h獲得的條件培養(yǎng)基組(IDO+1-MT CM組)。培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，采用定量

7、RT-PCR法分別檢測(cè)CD56+dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞表面受體NKp46 mRNA及NKG2D mRNA表達(dá)水平，F(xiàn)CM法分析NKp46及NKG2D蛋白質(zhì)表達(dá)水平。(4)進(jìn)一步采用LDH法檢測(cè)CD56+ dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。(5)ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的TNF-α水平。 結(jié)論：HTR-8/SVneo表達(dá)的IDO能夠下調(diào)pNK細(xì)胞表面NKp46及NKG2D受體表達(dá)，并降低pnK殺傷活性和分泌TNF-α的能

8、力，而不降低dNK細(xì)胞殺傷活性等功能。 第三部分:妊娠早期蛻膜組織中BDCA-1(+)，BDCA-2(+)和BOCA-3(+)樹(shù)突狀細(xì)胞的分布和表型特點(diǎn) 目的：利用新近發(fā)現(xiàn)的BDCA標(biāo)志來(lái)檢測(cè)妊娠早期蛻膜組織中DC亞群及其表型特點(diǎn)，并進(jìn)一步分析DC亞群數(shù)量隨孕周變化的特點(diǎn)。 方法：(1)機(jī)械法分離6-9孕周(n=44，每孕周11例)蛻膜組織中的單個(gè)核細(xì)胞，F(xiàn)CM法檢測(cè)蛻膜單個(gè)核細(xì)胞中BDCA-1+MDC1，BDC

9、A-3+MDC2和BDCA-2+PDC亞群。(2)FCM法進(jìn)一步檢測(cè)BDCA-1+MDC1和BDCA-3+MDC2亞群的表型特點(diǎn)，分析HLA-DR、CD86、CD80和ILT3的表達(dá)水平。(3)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)妊娠早期蛻膜組織(n=12)中BDCA-1+和BDCA-3+細(xì)胞。 結(jié)論：我們首次描述了妊娠早期蛻膜組織中存在BDCA-1+CD19-CD14-MDC1，BDCA-3+CD14-MDC2和BDCA-2+CD123+PDC