七氟醚對樹突狀細胞成熟過程及成熟樹突狀細胞活力的影響.pdf

1、目的:七氟醚(Sevoflurane)是一種新型的鹵族類麻醉藥,其理化性質(zhì)穩(wěn)定,誘導迅速,對氣道刺激性小,對循環(huán)系統(tǒng)抑制輕,蘇醒快而完全,且無組織毒性,是臨床上應用較廣泛的的吸入性麻醉藥。樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是迄今為止功能最強的專職抗原提呈細胞(APC),也是唯一能夠在體內(nèi)外激活初始T淋巴細胞的APC,在啟動細胞免疫應答中發(fā)揮重要作用,但是骨髓中新生成的Des前體一般需要經(jīng)過三個階段即未成熟階段、遷移階段、成

2、熟階段才能提呈抗原并啟動免疫應答,而從免疫表型上則分為未成熟樹突狀細胞和成熟樹突狀細胞。本實驗通過七氟醚作用于兩種表型的樹突狀細胞即未成熟樹突狀細胞(imDCs)和成熟樹突狀細胞(mDCs),來探討七氟醚對樹突狀細胞成熟過程及成熟樹突狀細胞活力的影響。
　　 方法:無菌條件下采集健康孕婦正常胎兒臍帶血70ml左右,用肝素抗凝。在超凈工作臺上用生理鹽水:臍帶血為1∶1的比例稀釋后,再按照稀釋血:淋巴細胞分離液之比為2∶1的比例緩緩

3、加到淋巴細胞分離液上層,密度梯度離心法獲得臍血單個核細胞(CBMC),將細胞用生理鹽水清洗3次后棄上清,加入無血清培養(yǎng)基重懸并計數(shù)單個核細胞,調(diào)整細胞密度為2×106/ml,接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔3ml。在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2h,移去懸浮細胞,無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌兩次,以去除殘留非貼壁細胞,保留貼壁細胞即為單核細胞,調(diào)整細胞數(shù)量為1×106/ml。加入細胞生長因子:即重組人類粒細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)50ng/

4、ml,重組人類白介素-4(rhIL-4)10ng/ml。然后隨機分為3組:常規(guī)培養(yǎng)組作為對照組(C組)、未成熟表型組(I組)、成熟表型組(M組)。C組:常規(guī)加入rhGM-CSF、rhIL-4及重組人類腫瘤壞死因子-α(rhTNF-α),在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)14d。I組:培養(yǎng)至第6天用2.5％七氟醚(為混合氣體體積分數(shù)),處理2h,其余同C組。M組:培養(yǎng)至第13天用2.5％七氟醚(為混合氣體體積分數(shù)),處理2h,其余同C組。

5、培養(yǎng)過程中每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態(tài)學變化。培養(yǎng)到第14d時收集細胞以流式細胞分析儀分析各組細胞免疫表型抗原CD80、CD86、CD83、HLA-DR(主要組織相容性復合體MHC-Ⅱ類分子之一)的表達率,收集培養(yǎng)到第14d的各組細胞培養(yǎng)上清液用雙抗體夾心免疫(ELISA)法測定其分泌IL-12的活力。取健康志愿者外周血20ml,同上述方法制備外周血單個核細胞(PBMC),加入含有10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,在培

6、養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h,收集懸浮細胞作為同種異體混合淋巴細胞,調(diào)整細胞數(shù)量為2.0x106/ml,用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7d作為反應細胞,培養(yǎng)到第14d的各組DCs作為刺激細胞,用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測DCs刺激混合淋巴細胞的增殖活力。
　　 結(jié)果:
　　 1七氟醚對各組DCs形態(tài)的影響:倒置顯微鏡觀察,七氟醚未處理之前,第2天,細胞大小均一,表面光滑,各組細胞均于第3-4天開始出現(xiàn)集落,細胞體積逐漸變大。見Fig

7、.1～2。第5-6天細胞表面不規(guī)則,有短毛刺樣突起;七氟醚處理后第14天觀察,與C組相比,I組細胞毛刺短粗,較稀少,M組與C組基本相似,細胞表面毛刺樣突起較多且長。見Fig.3～7。掃描電鏡觀察細胞表面狀態(tài)與以上結(jié)果一致。見Fig.8～10。
　　 2七氟醚對DCs免疫表型抗原陽性率的影響:CD80/CD86、CD83/HLA-DR表達率,C組細胞分別為36.94±2.85％、12.91±2.44％,I組細胞表面表型較低分別為1

8、9.64±2.57％、7.12±1.45％,兩組差異有顯著性(P＜0.05),而M組與C組無明顯差異(P＞0.05)。見Table1
　　 3七氟醚對DCs刺激混合淋巴細胞增殖反應活力的影響:I組細胞刺激T細胞增殖活力較弱,M組與C組比較無明顯差異。見Table2
　　 4七氟醚對DCs分泌IL-12活力的影響:C組分泌IL-12水平為958.22±321.21 pg/ml,I組分泌IL-12活力較C組較弱為377.14