米非司酮對人外周血來源樹突狀細胞成熟和功能的影響.pdf

1、生殖免疫學(xué)的核心問題是母體對半同種異體移植物（胚胎）的耐受機制，這個謎團目前尚未被解開。既往的研究認為，母胎界面的局部免疫應(yīng)答是母胎免疫耐受建立和維持的關(guān)鍵。母胎界面免疫微環(huán)境由子宮粘膜的免疫細胞及其分泌的細胞因子組成。目前對于子宮自然殺傷細胞（uterine natural killer cell，uNK）、T細胞在母胎免疫耐受中的作用研究比較深入，但對于樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)在母胎免疫耐受中的作用研究甚

2、少。
　　 DCs是機體內(nèi)功能最強大的專職性抗原提呈細胞(antigen-presenting cell，APC)，是特異性免疫應(yīng)答的始動者，其激活T細胞的能力為巨噬細胞、B細胞的1000倍。人類DCs主要來源于骨髓CD34?造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSC)，廣泛分布于機體粘膜表面，不僅能直接或間接激活T細胞、B細胞，引發(fā)機體免疫排斥，還能誘導(dǎo)免疫耐受，在機體對某些抗原免疫耐受的建立過程中發(fā)

3、揮了重要作用。自從20世紀末DCs被正式確認以來，對DCs在免疫反應(yīng)中的作用及機制的了解是近10年來免疫學(xué)領(lǐng)域最重大的進展之一。目前對DCs研究的熱點是DCs在免疫激活及免疫耐受中的作用及機制。一般認為，成熟DCs誘導(dǎo)免疫激活，傾向于引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，不成熟DCs傾向于誘導(dǎo)機體免疫耐受。最新的研究證實人子宮內(nèi)膜及蛻膜均含有DCs，在抵御外來病原體入侵及母胎免疫調(diào)控中起了重要作用。
　　 米非司酮是一種高效孕激素受體與糖皮質(zhì)激素受

4、體拮抗劑，近年來成功用于緊急避孕，其用藥劑量在逐步減少。單次米非司酮劑量減到10mg，其避孕有效性仍很高，且不良反應(yīng)少，對月經(jīng)周期影響小，為目前通用的緊急避孕劑量。最新的研究發(fā)現(xiàn)低劑量米非司酮有望發(fā)展成一種新型的不抑制排卵的常規(guī)避孕藥。每日給予低劑量米非司酮（1 mg/d，穩(wěn)態(tài)血藥濃度65 nmol/L），不抑制排卵，但可使子宮內(nèi)膜發(fā)育延遲，不利于胚胎著床而起到避孕效果，被稱為“內(nèi)膜避孕”，但其相關(guān)機制，尤其是免疫學(xué)機制研究甚少。

5、>　　 本研究首先利用免疫組化技術(shù)觀察DCs在人正常子宮內(nèi)膜的分布及周期性變化，探索DCs在母胎免疫耐受中的作用。在成功制備人外周血來源DCs的基礎(chǔ)上，在體外以不同濃度米非司酮作用于DCs，觀察米非司酮對DCs成熟及生物學(xué)功能的影響，探索米非司酮作為內(nèi)膜避孕藥及緊急避孕藥的免疫學(xué)機制。
　　 第一部分人正常子宮內(nèi)膜DCs周期性變化研究
　　 目的：
　　 研究DCs在人正常子宮內(nèi)膜的分布及周期性變化，探討DCs

6、在母胎免疫耐受中的作用。
　　 方法：
　　 40例正常子宮內(nèi)膜樣本取自具有正常月經(jīng)周期的育齡女性，20例處于增生期（月經(jīng)周期第6至10天），20例處于植入窗期（月經(jīng)周期第20至24天）.常規(guī)HE染色判定組織學(xué)分期。免疫組化染色觀察CDla、CD83陽性細胞在子宮內(nèi)膜的表達情況。結(jié)合血清雌二醇(E?)、孕酮(P)水平，分析DCs表達水平與E?、P的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.人子宮內(nèi)膜存在CDla?

7、DCs。植入窗期子宮內(nèi)膜CDla?DCs陽性率為100％，增生期子宮內(nèi)膜CDla?DCs陽性率為90％(18/20)。
　　 2.人子宮內(nèi)膜DCs數(shù)量隨月經(jīng)周期變化而變化，植入窗期CDla?DCs細胞密度為18.2±5.76 cells/mm2，顯著高于增生期子宮內(nèi)膜CDla?DCs細胞密度(6.5±4.05 cells/mm2，P<0.05).
　　 3.子宮內(nèi)膜DCs數(shù)量與血清孕激素水具有相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)為0.630

8、，P<0.01）。
　　 4.未發(fā)現(xiàn)CD83?成熟DCs存在于人正常子宮內(nèi)膜。
　　 結(jié)論：
　　 1.人子宮內(nèi)膜存在DCs，為未成熟DCs。
　　 2.人子宮內(nèi)膜DCs數(shù)量隨月經(jīng)周期變化而變化，受卵巢性激素調(diào)節(jié)。
　　 3.植入窗期子宮內(nèi)膜未成熟DCs數(shù)量顯著上升，這可能有利于胚胎順利著床，誘導(dǎo)母胎耐受。
　　 第二部分人外周血來源DCs的體外擴增及鑒定
　　 目的：
　　

9、 從健康人外周血中分離和純化單核細胞，體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為DCs，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 淋巴細胞分離液密度梯度離心法從健康成年女性外周血濃縮白細胞分離獲得單個核細胞。免疫磁珠分選CD14?單核細胞。純化后的CDl4?單核細胞在含有100 ng/mlrhGM-CSF、20 ng/ml rhlL-4的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天分化成為未成熟DCs。加入100 ng/ml LPS繼續(xù)培養(yǎng)48小時誘導(dǎo)D

10、Cs成熟。相差顯微鏡及掃描電鏡觀察細胞形態(tài).流式細胞儀分析細胞免疫表型。混合淋巴細胞反應(yīng)(mixed leukocytereacTiO2s，MLR)檢測DCs刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力。
　　 結(jié)果：
　　 1.單核細胞體外培養(yǎng)6天后，相差顯微鏡、掃描電鏡觀察到細胞呈現(xiàn)典型DCs形態(tài)。
　　 2.新鮮分離的單核細胞表型為CD14?CD1a?。體外培養(yǎng)6天后成功分化為未成熟DCs，流式細胞術(shù)分析表型為CD14

11、?Cdla?HLA-DRlowCD83?。在不同的刺激細胞/反應(yīng)細胞比例下（DC/T1:125，1:25，1:5），MTT法測定OD值分別為0.1123，0.1975，0.3665，即刺激T細胞增殖的能力較弱。
　　 3.培養(yǎng)第8天的細胞（LPS促成熟48小時），顯著上調(diào)表達HLA-DR及CD83分子（P<0.05）。在不同的刺激細胞/反應(yīng)細胞比例下(DC/T1：125，1:25，1：5)，OD值分別為0.1563，0.2825

12、，0.5180，與培養(yǎng)第6天的細胞相比，具有很強的刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力(P<0.05)，其刺激能力隨著刺激細胞/反應(yīng)細胞比例（DC/T）升高而增強。
　　 結(jié)論：
　　 人外周血CD14?單核細胞經(jīng)GM-CSF和IL-4體外培養(yǎng)獲得大量DCs。細胞形態(tài)、免疫表型及混合淋巴細胞反應(yīng)證實其為典型DCs。
　　 第三部分米非司酮對人外周血來源DCs成熟和功能的影響
　　 目的：
　　 在成功

13、制備人外周血來源DCs的基礎(chǔ)上，在體外以不同濃度米非司酮作用于DCs，觀察米非司酮對DCs成熟及生物學(xué)功能的影響，探索米非司酮作為抗著床避孕藥及緊急避孕藥的免疫學(xué)機制。
　　 方法：
　　 人外周血CD14?單核細胞在體外經(jīng)GM-CSF、IL-4培養(yǎng)6天誘導(dǎo)分化為未成熟DCs。加入不同劑量的米非司酮（20 nmol/L，65 nmol/L,200 nmol/L和1800 nmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)48小時，同時設(shè)置陽性對照組

14、（加入100 ng/ml LPS），陰性對照組及溶劑對照組（加入米非司酮溶劑dimethyl sulphoxide，DMSO）。流式細胞儀檢測和分析細胞表面CDla、CD83和HLA-DR分子的表達情況。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzymelinked immunosorbnent assay,ELSIA)檢測DCs培養(yǎng)上清液中IL-12p70水平。MLR檢測各組DCs刺激同種異體T細胞增殖的能力。
　　 結(jié)果：
　　 1.米

15、非司酮上調(diào)DCs表面HLA-DR及CD83分子表達。
　　 2.與陰性對照組相比，米非司酮處理組DCs分泌的IL-12p70水平顯著升高（P<0.05）。在一定范圍內(nèi)（20 nmol/L～200 nmol/L），米非司酮促進DCs分泌IL-12p70的能力隨著米非司酮濃度增大而增強。
　　 3.與陰性對照組相比，米非司酮處理組DCs刺激同種異體T細胞增殖的能力明顯增強(P<0.05)。在一定范圍內(nèi)（20 nmol/L～2

16、00 nmol/L），米非司酮促進DCs刺激T細胞增殖的能力隨著米非司酮濃度增大而增強。
　　 結(jié)論：
　　 1.米非司酮誘導(dǎo)DCs表型成熟，促進DCs分泌IL-12并增強其刺激T淋巴細胞增殖的能力。
　　 2.在一定濃度范圍內(nèi)，米非司酮對DCs的促成熟作用存在量效關(guān)系。
　　 3.米非司酮可能通過促進DCs成熟，引發(fā)母體對半同種異體胎兒抗原免疫排斥，達到抗著床避孕。
　　 4.米非司酮緊急避孕的