rAAV-AFP轉(zhuǎn)染對人外周血單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞免疫刺激功能研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)2 0 0 2 級碩士學(xué)位論文r A A V ／A F P 轉(zhuǎn)染對人外周血單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞免疫刺激功能研究C o i n f e c t i o n o f r A A V ／A F P e n h a n c e s t h ei m m u n o s t i m u l a t o r ye f f e c to f h u m a n p e r i p h e r a lb l o o dm o n o c

2、y t e d e n d r i t i cc e l l s課題來源：合作項目專 業(yè)名 稱 腫瘤學(xué)學(xué)位申請人梁政指 導(dǎo)教師 羅榮城教授答辯委員會主席答辯委員會成員陳尊器教授劉勇教授韓煥興教授李金瀚教授季晨陽副教授論文評閱人 韓煥興教授廖旺軍副教授2 0 0 5 年5 月6 日摘要r A A V ，A F P —D C 組，并另設(shè)一組不加r A A V ／A F P 組為N —r A A V ／A F P —D C 組；在3 7 。C

3、 、5 ％C 0 2 培養(yǎng)箱中以含重組G M —C S F8 0 0 U ／m l 的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；1 2 h 后小心洗去r A A V ／A F P ，在同上培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)；第3 天，以含重組G M —C S F 8 0 0 U ／m l 和白細(xì)胞介素_ 4 ( 幾．4 ) 1 0 0 0U ／m l 的無血清培養(yǎng)基半量換液；第5 天，使用上述培養(yǎng)基全量換液；第6 天將腫瘤壞死因子n ( T N F —n ) 2 0 &#

4、168;g ／L 加入培養(yǎng)基中；第7 天培養(yǎng)獲得成熟D C 。2 ．在倒置顯微鏡下每天記錄比較形態(tài)學(xué)變化。3 ．收集培養(yǎng)過程中的D C ，從第3 天起至1 1 天。每天均取約l m l ( 2 4 孔板中1孔) 細(xì)胞懸液，振蕩均勻后將待測細(xì)胞懸液與1 ％苔盼蘭一平衡鹽溶液兩者等體積均勻混合，取1 0 p ．1 混合液沖于細(xì)胞計數(shù)板內(nèi)，3 分鐘內(nèi)光鏡下直接分別細(xì)胞計數(shù)，計算出活D C 細(xì)胞百分率。4 ．以異硫氰酸熒光素( F r r c

5、) 或藻紅蛋白( P E ) 標(biāo)記的鼠抗C D 8 0 、C D 8 6 、C D 8 3 、C D 4 0 、C D l a 、H L A ．D R 抗體結(jié)合D C ，并以流式細(xì)胞儀分析比較D C表面分子的表達。5 ．r A A V ／A F P 感染3 天后，收集細(xì)胞，加入鼠抗A F P 單抗，4 0 c 孵育4 0 r a i n ，P B S 洗2 次，重懸細(xì)胞，加入F I T C 標(biāo)記的兔抗鼠單抗，4 。C 避光孵育4 0 m

6、 i n ，P B S 洗2 次，流式細(xì)胞儀檢測r A A V ／A F P 病毒感染效率及A F P 表達情況。6 ．非貼壁細(xì)胞在含白細(xì)胞介素一2 ( I L 一2 ) 2 0 0 U ／m l 及5 ％人A B 血清的R P M l l 6 4 0培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第4 天全量換液。7 ．待D C 成熟后，將非貼壁細(xì)胞加在3 7 。C 預(yù)溫的尼龍毛柱上，3 7 0 C 、5 ％C 0 2 孵育3 0 m i n 后，經(jīng)預(yù)溫的R P M

7、l l 6 4 0 輕輕洗出細(xì)胞，所獲細(xì)胞作為T 細(xì)胞備用，計數(shù)，并用R P M l l 6 4 0 培養(yǎng)液懸浮；分別取培養(yǎng)成熟的r A A V ／A F P - D C 組以及培養(yǎng)同樣長時間N —r A A V ／A F P —D C 組用2 5 r n g ／L 的絲裂霉素C 抑制增殖；按D C ：T 為1 ：1 5 將T 細(xì)胞加入D C 細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)；3 天后，E P 管收集細(xì)胞，P B S 洗滌2 次，制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，