洛沙坦對(duì)人單核細(xì)胞源樹突狀細(xì)胞免疫成熟的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分氧化低密度脂蛋白和洛沙坦對(duì)樹突狀細(xì)胞免疫成熟的影響
　　 目的：探討血管緊張素Ⅱ受體1(AT1)拮抗劑(ARB)類藥物洛沙坦對(duì)由氧化低密度脂蛋白(OxLDL)誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞源樹突狀細(xì)胞(DCs)免疫成熟進(jìn)程的影響。
　　 方法：采用密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠法分離人外周血CD14+單核細(xì)胞，經(jīng)含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)5天，使其分化為未成熟DC

2、s。在細(xì)胞培養(yǎng)的第六天分別加入終濃度為10、50、100μg/ml的OxLDL，干預(yù)24小時(shí)，另用10μM的洛沙坦預(yù)干預(yù)24小時(shí)后再加入50μg/mlOxLDL干預(yù)24小時(shí)，以PBS作為陰性對(duì)照。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞免疫表型(CD80、HLA-DR)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子(IL-10、IL-12和。IFN-γ)的濃度。
　　 結(jié)果：與PBS組相比，OxLDL干預(yù)呈濃度依賴性上調(diào)DCs表面共刺激分子CD80和

3、成熟度標(biāo)志HLA-DR的表達(dá)，且分泌細(xì)胞因子IL-10、IL-12和IFN-γ水平明顯升高，也呈濃度依賴性。與濃度為50μg/ml的OxLDL干預(yù)組相比，10μM洛沙坦預(yù)處理可明顯抑制OxLDL誘導(dǎo)的CD80、HLA-DR表面分子的表達(dá)，并減弱OxLDL誘導(dǎo)的DCs分泌細(xì)胞因子IL-10、IL-12和IFN-γ。
　　 結(jié)論：OxLDL是DCs免疫成熟和功能活化的重要刺激因素，而ARB類藥物洛沙坦可抑制OxLDL誘導(dǎo)的DCs免疫

4、成熟，這可能是其抗AS的一個(gè)重要機(jī)制。
　　 第二部分血管緊張素Ⅱ和洛沙坦對(duì)樹突狀細(xì)胞免疫成熟的影響
　　 目的：探討血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和洛沙坦對(duì)人單核細(xì)胞源DCs免疫成熟進(jìn)程的影響。
　　 方法：采用密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠法分離人外周血CD14+單核細(xì)胞，經(jīng)含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)5天，使其分化為未成熟DCs。在細(xì)胞培養(yǎng)的第六天分別

5、加入終濃度為10nM、100nM的AngⅡ干預(yù)24小時(shí)，另用10μM的洛沙坦預(yù)干預(yù)24小時(shí)后再加入100nM的AngⅡ干預(yù)24小時(shí)，以PBS作為陰性對(duì)照。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞免疫表型(CD80、HLA-DR)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子(IL-10、IL-12和IFN-γ)的濃度。
　　 結(jié)果：與PBS組相比，AngⅡ干預(yù)后DCs表達(dá)共刺激分子CD80和成熟度標(biāo)志HLA-DR明顯增加，且分泌細(xì)胞因子IL-10、I

6、L-12和IFN-γ水平明顯升高，均呈濃度依賴性。與濃度為100nM AngⅡ干預(yù)的DCs相比，10μM的洛沙坦預(yù)處理可明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CD80、HLA-DR表面分子的表達(dá)和細(xì)胞因子IL-10、IL-12和IFN-γ的分泌。
　　 結(jié)論：AngⅡ是DCs免疫成熟和功能活化的重要刺激因素，而ARB類藥物洛沙坦通過阻斷AT1可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的DCs免疫成熟，這可能是其抗AS的一個(gè)重要機(jī)制。 第三部分洛沙坦對(duì)樹突狀細(xì)胞免疫成熟

7、影響的機(jī)制研究
　　 目的：探討ARB類藥物洛沙坦對(duì)OxLDL和AngⅡ誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞源DCs免疫成熟影響的機(jī)制。
　　 方法：采用密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠法分離人外周血CDl4+單核細(xì)胞，經(jīng)含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的RFMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)5天，使其分化為未成熟DCs。根據(jù)干預(yù)因素的不同將細(xì)胞分為下列七組①10μg/mlOxLDL、②50μg/ml OxLDL、③100μ

8、g/ml OxLDL、④50μg/ml OxLDL+10μM洛沙坦、⑤10nM AngⅡ、⑥100nM AngⅡ、⑦100nM AngⅡ+10μM洛沙坦，干預(yù)24小時(shí)后收集細(xì)胞，以PBS作為陰性對(duì)照。采用ELISA法檢測(cè)上述①-④組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AngⅡ的濃度，采用Real-time PCR法和Western-blot法分別檢測(cè)DCs清道夫受體SR-A、CD36和LOX-1的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：與PBS組相比，

9、不同濃度OxLDL干預(yù)可濃度依賴性促進(jìn)DCs自分泌AngⅡ；與濃度為50μg/ml OxLDL干預(yù)的DCs相比，10μM的洛沙坦預(yù)處理對(duì)AngⅡ的分泌無明顯影響。未經(jīng)干預(yù)的DCs可表達(dá)少量的清道夫受體，OxLDL干預(yù)后呈濃度依賴性上調(diào)SR-A、CD36和LOX-1mRNA和蛋白的表達(dá)；與濃度為50μg/ml的OxLDL干預(yù)相比，10μM洛沙坦預(yù)處理可明顯抑制LOX-1mRNA和蛋白的表達(dá)，但SR-A和CD36的表達(dá)無明顯變化。與PBS組

10、相比，AngⅡ干預(yù)也可濃度依賴性上調(diào)LOX-1mRNA和蛋白的表達(dá)，但對(duì)SR-A和CD36的表達(dá)無明顯影響；與濃度為100nM的AngⅡ干預(yù)相比，10μM洛沙坦預(yù)處理可明顯抑制LOX-1mRNA和蛋白的表達(dá)，但SR-A和CD36的表達(dá)無明顯變化。
　　 結(jié)論：AngⅡ可通過活化AT1受體，上調(diào)LOX-1的表達(dá)，促進(jìn)DCs對(duì)OxLDL的攝取，這可能是AngⅡ促AS的新機(jī)制；OxLDL可呈濃度依賴性上調(diào)DCs表面多種SR的表達(dá)，還可