STIM1-STIM2調(diào)控人外周血單核細(xì)胞性樹突狀細(xì)胞FcγRII功能.pdf

1、背景
　　樹突狀細(xì)胞(DCs)是體內(nèi)功能最為強大的專職抗原遞呈細(xì)胞(APCs),直接調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答和免疫耐受之間的平衡。DCs的雙向調(diào)節(jié)功能與其自身發(fā)育的不同階段密切相關(guān),同時DCs的分化成熟又與其表面FcgR表達密不可分。前期研究發(fā)現(xiàn)DCs及其前體細(xì)胞表面的激活型和抑制型FcγR參與調(diào)控細(xì)胞的分化成熟和免疫學(xué)功能。FcγR參與DCs分化、成熟以及免疫效應(yīng)主要由其自身激活型基序(ITAM)和抑制型基序(ITIM)所決定的?；|(zhì)交

2、感分子-1(STIM1)是近年發(fā)現(xiàn)的Ca2+通道調(diào)節(jié)蛋白,堪稱細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上偵測鈣離子含量的感應(yīng)器(sensor),是“填充式Ca2+涌入理論”(capacitative calcium influx)體系中的重要分子,具有潛在的有效調(diào)節(jié)DCs免疫功能的作用?；|(zhì)交感分子-2(STIM2)是調(diào)控基礎(chǔ)Ca2+流入的主要分子,在Ca2+通道應(yīng)答的后期階段扮演重要角色。細(xì)胞Ca2+的流動不但參與調(diào)節(jié)T、B等免疫細(xì)胞的功能,同時也是細(xì)胞表面免疫受

3、體胞內(nèi)共有的ITAM和ITIM發(fā)揮激活和抑制功能的主要元素。由于FcgRs發(fā)揮功能是通過胞內(nèi)ITAM和ITIM引起Ca2+的流動實現(xiàn),而Ca2+的流動本身可能是影響DCs分化成熟的重要環(huán)節(jié)。因此,探索STIM1和STIM2在FcgRs調(diào)控DCs分化成熟中的作用對闡明DCs的免疫調(diào)節(jié)機制,發(fā)掘DCs調(diào)控免疫反應(yīng)的靶點有重要的科學(xué)意義。
　　目的:
　　通過探討STIM1及STIM2在FcgR調(diào)控樹突狀細(xì)胞成熟中的作用,闡明ST

4、IM1和STIM2在DCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)中的作用。
　　方法:
　　1.DCs體外培養(yǎng)體系的建立
　　采用密度梯度離心法,分離人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)利用單核細(xì)胞貼壁特性,獲取單核細(xì)胞。采用重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)100ng/mL聯(lián)合重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)100ng/mL刺激6天收獲未成熟DCs(iDCs);第6天加入脂多糖(LPS)1μg/mL刺激24h后收獲成熟DCs(mDCs

5、)。采用倒置相差顯微鏡觀察DCs形態(tài)學(xué)變化,流式細(xì)胞儀鑒定DCs表型。
　　2.激活FcgR受體對STIM1和STIM2表達的影響
　　流式細(xì)胞儀和免疫熒光檢測DCs表面激活型受體FcγRIIa和抑制型受體FcγRIIb的表達;Real-time PCR和Western-Bolt檢測iDCs和mDCs中STIM1和STIM2的表達差異;分別采用IV.3和7.3與 F(ab’)2結(jié)合形成免疫復(fù)合物,分別交聯(lián)DCs表面激活型和抑

6、制型FcγR后,使用Real-time PCR和Western-Bolt檢測交聯(lián)3min和30min后,細(xì)胞內(nèi) STIM1和STIM2的表達差異。
　　3.STIM1和STIM2的RNA干擾體系建立及鑒定
　　采用化學(xué)法合成siRNA,通過Lipo化學(xué)轉(zhuǎn)染法遞送siRNA進入DCs,采用Real-time PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效果,MTT法檢測轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞活性。
　　4.調(diào)節(jié)STIM1和STIM2的表達對DCs成熟的

7、影響
　　采用siRNA技術(shù)分別沉默DCs中STIM1和STIM2的表達,流式細(xì)胞儀檢測DCs表型。
　　結(jié)果:
　　1.iDCs高表達抑制型受體FcγRIIb(MFI,1572±114.6),LPS誘DCs成熟后 FcγRIIb中度降低(MFI,900±21),激活型受體 FcγRIIa表達未見明顯變化(MFI,740±51)。
　　2.DCs高表達STIM2,而DCs成熟后STIM1的表達明顯增高(P<0.0

8、5)。采用siRNA干擾技術(shù)可以有效抑制STIM1和STIM2的表達,其抑制率分別為70.1％和65.8％,且對DCs活性無明顯影響, DCs存活率分別為(94.17±12.38)％和(99.17±5.07)％。沉默DCs內(nèi)STIM1和STIM2,DCs的成熟狀態(tài)未見明顯變化(P>0.05),仍高表達CD80、CD86、HLA-DR、CD40、CD83。
　　3.交聯(lián)DCs表面激活型和抑制型FcγR3min后,STIM1和STIM

9、2未見明顯變化,與對照組相比,STIM2 mRNA的表達明顯降低,然而交聯(lián)抑制型受體FcγRIIb30min后,STIM1和STIM2表達明顯增高(P<0.01),交聯(lián) FcγRIIa后,STIM1和STIM2表達明顯降低(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.DCs同時表達STIM1和STIM2兩種蛋白,且主要表達STIM2, STIM1隨DCs成熟表達量明顯增加;
　　2.抑制STIM1和STIM2兩種蛋白的表達,